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Monitoring the Structural Changes of pre-edited mRNAs upon Editosome Binding - Evidence for the Evolutionary Origin of RNA-Editing

Leeder, Wolf-Matthias (2016)
Monitoring the Structural Changes of pre-edited mRNAs upon Editosome Binding - Evidence for the Evolutionary Origin of RNA-Editing.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication

Monitoring the Structural Changes of pre-edited mRNAs upon Editosome Binding.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Monitoring the Structural Changes of pre-edited mRNAs upon Editosome Binding - Evidence for the Evolutionary Origin of RNA-Editing
Language: English
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich ; Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Date: 21 July 2016
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 8 July 2016

Chapter I: Mitochondrial transcript maturation in African trypanosomes requires an RNA editing reaction that is characterized by the insertion and deletion of U-nucleotides into otherwise non-functional mRNAs. The reaction is catalyzed by editosomes and requires guide (g)RNAs as templates. Recent data demonstrate that the binding of pre-edited mRNAs to editosomes is followed by a chaperone-type RNA remodeling reaction. Here we map the changes in RNA folding using selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). We demonstrate that pre-mRNAs in their free state adopt intricately folded, highly stable 2D-structures. Editosome binding renders the pre-mRNAs to adopt 2D-conformations of reduced stabilities. On average about 30% of the nucleotides in every pre-mRNA are affected with a prevalence for U-nucleotides. The data demonstrate that the chaperone activity acts by increasing the flexibility of U-residues to lower their base-pairing probability. This results in a simplified RNA folding landscape with a reduced energy barrier to facilitate the binding of gRNAs. The data provide a first rational for the enigmatic U−specificity of the editing reaction.

Chapter II: Mitochondrial transcript maturation in African trypanosomes requires a U-nucleotide specific RNA editing reaction. In its most extreme form hundreds of U’s are inserted into and deleted from primary transcripts to generate functional mRNAs. Unfortunately, the evolutionary origin and the biological necessity of the process have remained enigmatic. Here we report a so far unrecognized structural feature of pre-edited mRNAs, which suggests a defined evolutionary origin. We demonstrate that the cryptic pre-mRNAs contain numerous clustered G-nt, which fold into G-quadruplex (GQ) structures. We identified 27 GQ’s in the different pre-mRNAs and demonstrate a positive correlation between the steady state abundance of guide (g)RNAs and the sequence position of GQ elements. We postulate that the driving force for selecting G-rich sequences lies in the formation of DNA/RNA hybrid G-quadruplex (HQ) structures between the pre-edited transcripts and the non-template strands of mitochondrial DNA. HQ’s are transcription termination and replication initiation sites and thus guarantee an unperturbed replication of the mt-genome. This is essential for maintaining the life cycle of the parasite. In the transcription-on state, the identified GQ’s require editing as a GQ-resolving activity suggesting that the two processes coevolved and identifying the cell- and life-cycle of the parasite as evolutionary forces.

Chapter III: Mitochondrial transcript maturation in African trypanosomes requires an RNA editing reaction in which non-functional pre-mRNAs are converted into translatable mRNAs. While the reaction is characterized by the site-specific insertion and deletion of exclusively U-nucleotides, some transcripts are edited through the insertion of hundreds of U’s, showcasing the cryptic nature of the various pre-mRNAs. In addition to the lack of nucleotide information, the different RNAs are further characterized by an unusual high G-content and as a consequence the formation of thermodynamically highly stable 2D-structures in the majority of cases even involving multiple G-quadruplex (GQ)-folds. Unfortunately, it is not clear whether these structures resemble the in vivo folds of the different RNAs given the extreme volume exclusion i.e. “crowding” conditions within the trypanosome mitochondrion. Here we analyze the effect(s) of volume exclusion on the structure of the mitochondrial RPS12 pre-mRNA. We use polyethylene glycol (PEG)4000 as a neutral macromolecular cosolute to mimick intra-mitochondrial solvent conditions and we monitor the structure of the RNA on a global scale and with nucleotide resolution. We demonstrate that macromolecular crowding has no impact on the 2D-fold of the RPS12 pre-mRNA and we conclude that the determined minimal free energy (MFE)-structure in dilute solvent conditions represent a good proxy for the folding of the RPS12 pre-mRNA within its mitochondrial solvent context.

Chapter IV: African trypanosomes cause a parasitic disease known as sleeping sickness. Mitochondrial transcript maturation in these organisms requires a RNA editing reaction that is characterized by the insertion and deletion of U-nucleotides into otherwise non-functional mRNAs. Editing represents an ideal target for a parasite-specific therapeutic intervention since the reaction cycle is absent in the infected host. In addition, editing relies on a macromolecular protein complex, the editosome, that only exists in the parasite. Therefore, all attempts to search for editing interfering compounds have been focused on molecules that bind to proteins of the editing machinery. However, in analogy to other RNA-driven biochemical pathways it should be possible to stall the reaction by targeting its substrate RNAs. Here we demonstrate inhibition of editing by specific aminoglycosides. The molecules bind into the major groove of the gRNA/pre-mRNA editing substrates thereby causing a stabilization of the RNA molecules through charge compensation and an increase in stacking. The data shed light on mechanistic details of the editing process and identify critical parameters for the development of new trypanocidal compounds.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Kapitel I: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion, die durch das Einfügen und Löschen von U-Nukleotiden in ansonsten nichtfunktionale mRNAs gekennzeichnet ist. Die Reaktion wird durch das Editosom katalysiert und erfordert guide(g)RNAs als Matrizen. Neuere Daten zeigen, dass auf die Bindung von pre-mRNAs an Editosome eine chaperonartige RNA-Restrukturierungsreaktion folgt. Hier verfolgen wir diese Strukturänderungen der RNAs durch selective 2’-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE). Wir zeigen, dass die pre-mRNAs in ihrem freien Zustand komplex gefaltete, hochstabile 2D-Strukturen einnehmen. Die Bindung der RNAs an das Editosom führt zu RNA-2D-Strukturen mit reduzierter Stabilität. Im Durchschnitt sind 30% der Nukleotide einer jeden RNA, mit einer Prävalenz für U-Nukleotide, betroffen. Die Daten zeigen, dass die Chaperoneaktivität die Flexibilität von U-Nukleotiden erhöht was zur einer Abnahme deren Basenpaarungswahrscheinlichkeiten führt. Dies resultiert in einer vereinfachten RNA-Faltungslandschaft und einer reduzierten Energiebarriere, was die Bindung von gRNAs erleichtert. Diese Daten liefern eine Erklärung für die enigmatische U-Spezifität der RNA-Editierungsreaktion.

Kapitel II: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion. In der extremsten Form werden hunderte Us zur Generierung funktionaler mRNAs in die Primärtranskripte eingefügt oder gelöscht. Sowohl der evolutionäre Ursprung als auch die biologische Notwendigkeit blieben rätselhaft. Hier beschreiben wir ein bisher unbemerktes strukturelles Merkmal der pre-editierten mRNAs, welches auf einen definierten evolutionären Ursprung hindeutet. Wir zeigen, dass die kryptischen pre-mRNAs zahlreiche, aufeinanderfolgende G-Nukleotide beherbergen, welche zu G-Quadruplexen (GQ) falten. Wir identifizierten 27 GQs in verschiedenen pre-mRNAs und zeigen eine positive Korrelation zwischen der gRNA-Abundanz im steady state und der Sequenzposition der GQ-Elemente. Wir postulieren, dass sich hinter der Selektion auf G-reiche Sequenzen die Formierung von DNA/RNA-hybrid-G-Quadruplexen (HQ) zwischen den pre-editierten mRNAs und den non-template strands des mitochondrialen Genoms als treibende Kraft verbirgt. HQs sind Transkriptionsstopp- und Replikationsinitiationsstellen und garantieren eine fehlerfreie Replikation des mitochondrialen Genoms. Dies ist essentiell für den Erhalt des Lebenszyklus des Parasiten. Im „Transkription-An“ Stadium ist die RNA-Editierungsreaktion als GQ-auflösender Mechanismus nötig, was darauf hinweist, dass die beiden Prozesse koevolviert sind und identifizieren den Zell- und Lebenszyklus des Parasiten als treibende evolutionäre Kräfte.

Kapitel III: Die Reifung mitochondrialer Transkripte in Afrikanischen Trypanosomen erfordert eine RNA-Editierungsreaktion durch welche nichtfunktionale pre-mRNAs zu translatierbaren mRNAs prozessiert werden. Die Reaktion ist gekennzeichnet durch das sequenzortsspezifische Einfügen oder Löschen von ausschließlich U-Nukleotiden. Manche Transkripte reifen durch das Einfügen von hunderten Us, was die kryptische Natur der verschiedenen pre-mRNAs verdeutlicht. Neben dem Fehlen von proteincodierender Information sind diese RNAs durch einen ungewöhnlich hohen G-Gehalt gekennzeichnet, was in der Mehrheit zur Ausprägung hoch stabiler 2D-Strukturen führt, welche teils sogar G-Quadruplex- (GQ)-Strukturelemente beherbergen. Aufgrund extremer „Crowding“-Bedingungen in den Mitochondrien Afrikanischer Trypanosomen ist unklar, ob diese Strukturen den in vivo Zustand widerspiegeln. Hier analysieren wir die Effekte von „Crowding“-Bedingungen auf die Struktur der mitochondrialen RPS12-pre-mRNA. Wir nutzen Polyethylenglykol (PEG4000) als neutrales, makromolekulares Kosolut zur Imitation der Lösemittelbedingungen innerhalb des Mitochondriums und wir bestimmen die Struktur der RNA auf globaler Ebene mit nukleotidgenauer Auflösung. Wir zeigen, dass durch Makromoleküle vermittelte „Crowding“-Bedingungen keinen Einfluss auf die 2D-Struktur der RPS12-pre-mRNA hat und folgern, dass die ermittelten Strukturen der minimalen Gibbs'schen freien Energie (MFE) in verdünnter Lösung eine gute Annäherung an die Strukturen im Kontext des mitochondrialen Systems darstellen.

Kapitel IV: Afrikanische Trypanosomen sind protozoische Parasiten und Erreger der Schlafkrankheit. Die Reifung mitochondrialer Transkripte in diesen Organismen benötigt eine RNA-Editierungsreaktion, welche durch das Einfügen und Löschen von U-Nukleotiden in ansonsten nichtfunktionale mRNAs gekennzeichnet ist. Die RNA-Editierungsreaktion ist ein ideales Ziel für die parasitenspezifische, therapeutische Intervention, da diese Reaktion im Wirt nicht vorkommt. Außerdem ist für die RNA-Editierungsreaktion ein makromolekularer Proteinkomplex notwendig, welcher nur im Parasiten existiert: Das Editosom. Aus diesem Grund begrenzte sich die Suche nach Inhibitoren der RNA-Editierungsreaktion auf Moleküle, welche an die Proteine des Editosoms binden. In Analogie zu anderen RNA-getriebenen Prozessen sollte es jedoch möglich sein, die RNA-Editierungsreaktion durch RNA-bindende Liganden zu stören. Hier beschreiben wir die Inhibition der RNA-Editierungsreaktion durch spezifische Aminoglykoside. Die Moleküle binden in die große Furche der gRNA/pre-mRNA-Editierungssubstrate, was zu einer Stabilisierung der RNA-Moleküle durch Ladungskompensation und einer Verstärkung der Basenstapelung führt. Die Daten geben Einblicke in die mechanistischen Details der RNA-Editierungsreaktion und identifizieren die kritischen Parameter für die Entwicklung trypanozider Wirkstoffe.

URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-55911
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Molecular Genetics
Date Deposited: 27 Jul 2016 06:09
Last Modified: 15 Jul 2020 08:34
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5591
PPN: 385179618
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