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Effects of ageing, calorie restriction and ageing-associated diseases on the mitochondrial proteome

Kratochwil, Manuela (2016)
Effects of ageing, calorie restriction and ageing-associated diseases on the mitochondrial proteome.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Effects of ageing, calorie restriction and ageing-associated diseases on the mitochondrial proteome
Language: English
Referees: Dencher, Prof. Dr. Norbert A. ; Laube, Prof. Dr. Bodo
Date: 2016
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 9 November 2015

This thesis outlines the effects of ageing, calorie restriction and ageing-associated diseases on the mitochondrial proteome. Several techniques were tested to study the mitochondrial proteome: Techniques for visualisation of proteins after two dimensional (2D) blue native (BN) / sodium dodecyl sulphate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were compared: staining of gels with Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBBG), silver and the fluorescent dye SYPRO®Ruby as well as labelling of the proteins before gel run with fluorescent dyes from Refraction-2D™ Labeling Kit (differential gel electrophoresis, DIGE). A recommendation was elaborated either for staining with fluorescent dye, when enough amount of protein is available, or for labelling with fluorescent dye, when analysis of low amount of protein is needed. Quantitation of the amount of mitochondrial oxidative phosphorylation (OxPhos) complexes after BN PAGE and subsequent CBBG staining was compared to quantitation after 2D-BN/SDS-PAGE and subsequent SYPRO®Ruby staining, using the rat brain tissue samples for the ageing and calorie restriction analyses (cerebellum, hippocampus and cerebrum). The results showed, that quantitation in CBBG stained BN gels is less accurate than in 2D-BN/SDS gels and subsequent SYPRO®Ruby staining, and therefore not applicable for detailed quantitation studies. The effects of ageing and calorie restriction were studied on the mitochondrial proteome of three different brain tissues of Fischer 344 rats: cerebellum, hippocampus and cerebrum. Animals were fed ad libitum (AL) or calorie restricted (CR, intake about 60 % of ad libitum fed animals, start point: after the age of 6 weeks) and analysed at two ages: 6.5 months (young, Y) and 27 months (old, O). Mitochondria were isolated and the mitochondrial proteins were separated by 2D-BN/SDS PAGE and identified by peptide mass fingerprint (PMF) with MALDI-MS. The protein amount of the assigned subunits was quantified by SYPRO®Ruby staining. BN PAGE of mitochondrial proteins and subsequent in-gel activity tests were applied to analyse the specific activity of the respiratory chain complexes I and IV. The mitochondrial membrane “fluidity” was determined by measurement of the steady-state fluorescence anisotropy of the intercalated probe diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH). In general, it was found that animals of young age under CR (YCR) developed a smaller body weight than young AL ones (YAL). Ageing under AL increased the body weight to the same extent as under CR. Commonly for all three tissues, the results of PMF showed that the migration pattern of subunits of mitochondrial proteins from rat brain tissues in 2D-BN/SDS PAGE are highly comparable, also to other mammalian tissue such as bovine heart. Therefore analyses of the proteome of the different tissues could be compared. The mtDNA encoded protein subunits CYB of OxPhos complex III (CIII) and COX2 of complex IV (CIV) did not show specific changes during ageing neither AL nor CR. Their changes followed the trends of total CIII and total CIV. The highest activities of CI were found in supercomplex I1III2IV3 and of CIV in supercomplex I1III2IV2 for all three brain tissues. However, the changes during ageing and calorie restriction of specific CI and CIV activities were not very pronounced. In cerebellum ageing of AL fed rats reduced the tissue weight and total mitochondrial protein amount as well as the fluidity of the mitochondrial membranes. The amount of OxPhos complexes and the activity was not altered. Already at young age the tissue weight of cerebellum decreased under CR and developed in the same way as in AL fed animals during ageing. The total mitochondrial protein amount in young and in old rats under CR was higher compared to AL fed rats, but it decreased during ageing under CR (YCR vs. OCR), thereof were proteins of cellular stress management, energy metabolism and neuronal composition. The amount of OxPhos complexes was decreased in young animals under CR compared to AL but increased during ageing to the same level of protein amount from animals under AL at old age. In general, the mitochondrial membrane fluidity decreased with ageing, even more in cerebellum of animals under CR than under AL. Already at young age under CR the fluidity was decreased compared to AL. For hippocampus the tissue weight, the total mitochondrial protein amount and CI activity in some (super-)complexes decreased by ageing independently from nutrition. Most of the analysed proteins decreased under AL and in young animals under CR. However, during ageing under CR the amounts of analysed proteins increased to a higher level in aged CR animals than aged AL animals. During ageing under AL the membrane “fluidity” did not change but in young and old animals under CR the membrane fluidity was decreased compared to the AL animals, even though the fluidity increased during age in CR animals. Decreased fluidity could be explained by increased cholesterol amount or increased membrane protein amounts and these could be needed to compensate for the decreased CI activity. In cerebrum the tissue weight decreased during ageing independently from nutrition. The amount of OxPhos complexes (excl. CV) decreased during ageing under AL while ageing under CR increased the protein amount of OxPhos complexes (excl. CV) in old rats. Ageing decreased the mitochondrial membrane “fluidity” in AL animals. Under CR the fluidity did not change, but was still increased in aged animals under CR compared to AL. In conclusion, ageing under AL decreased brain tissue weight, total protein amount and fluidity of mitochondrial membrane. The amount of the OxPhos complexes and their activity remained mainly unchanged. During ageing under CR the total protein amount increased and membrane fluidities decreased which, in terms of remained OxPhos complexes activities, seem to be part of compensation processes. Together with Dr. Koziel (IBA) the effects of ageing (senescence) were studied on a cell culture model, human umbilical vein endothelial cells, in which NADPH oxidase 4 (Nox4), known as producer of reactive oxygen species, was knocked down. The results showed a depleted CI amount and reduced CI activity under the influence of Nox4 which were both increased when Nox4 was knocked down. In collaboration with Dr. Kuter (IF-PAN) an early stage model of the ageing-associated disease Morbus Parkinson was studied. The effects of neuronal degradation in substantia nigra on the mitochondrial proteome were analysed in Wistar rats. For identification of proteins, 2D-BN/SDS PAGE and subsequent PMF were performed. Quantitation was achieved by application of DIGE. In-gel activities of OxPhos complexes I and IV were measured as well as membrane “fluidity”. The evaluation of the obtained results is still in progress. Some of the data were already submitted and are under review and for copyright reasons not described in this thesis.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Diese Arbeit befasst sich mit den Auswirkungen des Alterns, der Kalorienrestriktion und von altersassoziierten Krankheiten auf das mitochondriale Proteom. Verschiedene Techniken wurden verglichen, um das mitochondriale Proteom zu analysieren: Die Visualisierung der Proteine nach Auftrennung mit der zwei-dimensionalen (2D) blau-nativen (BN) Natriumdodecylsulfat-(SDS) Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) durch die Färbung der Gele mit Coomassie Brilliant Blau G-250 (CBBG), Silber oder dem Fluores-zenzfarbstoff SYPRO®Ruby wurden mit der differentiellen Gelelektrophorese (DIGE) verglichen, bei der vor dem Gellauf die kovalente Markierung der Proteine mit Fluoreszenz-farbstoffen (Refraction-2D™ Labeling Kit) stattfindet. Die Färbung mit Fluoreszenzfarbstoff wurde empfohlen, wenn genug Protein zur Verfügung steht und falls die Menge eingeschränkt ist für die Markierung der Proteine mit Fluoreszenzfarbstoff. Die Quantifizierung der Menge von mitochondrialen Proteinen der oxidativen Phosphory-lierung (OxPhos) nach Auftrennung durch BN PAGE und anschließender CBBG Färbung wurde verglichen mit der Auftrennung mittels 2D-BN/SDS PAGE und SYPRO®Ruby Färbung. Hierfür wurden dieselben Proben verwendet, die auch für die Analyse der Einflüsse von Altern und Kalorienrestriktion auf das mitochondriale Proteom der unterschiedlichen Gehirngewebe verwendet wurden. Die Quantifizierung nach BN PAGE und CBBG Färbung lieferte weniger genaue Resultate als die 2D-BN/SDS PAGE und SYPRO®Ruby Färbung und ist daher nicht geeignet für quantitative Analysen. Die Einflüsse von Altern und Kalorienrestriktion wurden am mitochondrialen Proteom von den drei Fischer 344 Rattenhirngeweben Cerebellum, Hippocampus und Cerebrum analysiert. Die Tiere wurden ad libitum (AL) gefüttert oder unter Kalorienrestriktion (CR, Aufnahme-menge etwa 60 % von AL, wurde nach Alter von 6 Wochen gestartet) gehalten. Zwei Alters-gruppen wurden analysiert: 6,5 Monate (jung, Y) und 27 Monate (alt, O). Die Mitochondrien wurden isoliert und deren Gesamtproteinmenge bestimmt. Die Proteine wurden mittels 2D-BN/SDS PAGE aufgetrennt und die Untereinheiten im Gel durch Peptide Mass Fingerprint (PMF) mittels MALDI-MS identifiziert. Die Proteinmenge der Untereinheiten wurde nach SYPRO®Ruby Färbung der Gele quantifiziert. Die Auftrennung der mitochondrialen Proteine mittels BN PAGE und anschließender in-Gel Aktivitätstests lieferte die spezifische Aktivität der OxPhos-Komplexe I (CI) und IV (CIV). Durch die steady-state Fluoreszenz-Anisotropie Messung der interkalierten Fluoreszenzsonde Diphenyl-1,3,5-hexatrien (DPH) wurde die „Fluidität“ der Mitochondrienmembran bestimmt. Bereits im jungen Alter hatten die Tiere unter CR ein niedrigeres Körpergewicht, als die AL gefütterten Tiere. Mit dem Altern erhöhte sich das Körpergewicht beider Tiergruppen im gleichen Maße. Nach Identifizierung der Proteinuntereinheiten mittels PMF im 2D-BN/SDS-Gel zeigte sich für Mitochondrien aus allen drei untersuchten Rattenhirngeweben, dass die elektrophoretische Mobilität der Untereinheiten annähernd identisch ist. Dies konnte ebenso für die untersuchten Rinderherzmitochondrien gezeigt werden. Daher konnten die Proteine der verschiedenen Gewebe miteinander verglichen werden. Die durch die mtDNS kodierten Untereinheiten CYB von OxPhos-Komplex III (CIII) und COX2 von CIV zeigten keine spezifischen Veränderungen beim Altern. Sie folgten den Veränderungen der Gesamt-komplexe CIII und CIV. Die höchsten Aktivitäten wurden in allen drei Geweben für die Superkomplexe I1III2IV3 (CI-Aktivität) und I1III2IV2 (CIV-Aktivität) gefunden. Allerdings waren die Veränderungen durch Altern und Kalorienrestriktion in den CI- und CIV-Aktivitäten nur sehr geringfügig ausgeprägt. Das Gewicht des Cerebellum, dessen mitochondriale Gesamtproteinmenge und die Fluidität der Mitochondrienmembran nahm mit dem Altern von AL gefütterten Tieren ab. Die Menge der OxPhos-Komplexe und die Aktivität von CI und CIV waren nicht verändert. Bereits junge Tiere unter CR wiesen ein geringeres Gewicht des Cerebellum verglichen mit AL gefütterten Ratten auf. Mit dem Altern wuchs das Cerebellum beider Tiergruppen im gleichen Maße an. Die mitochondriale Gesamtproteinmenge in jungen und alten Ratten unter CR war jeweils höher als bei den AL gefütterten Tieren, verringerte sich jedoch auch während des Alterns. darunter die Proteine des zellulären Stressmanagements, des Energiemetabolismus und an der neuronalen Zusammensetzung und Funktion beteiligten Proteine. Die Menge der OxPhos-Komplexe war in jungen Tieren unter CR verringert, erhöhte sich aber mit dem Altern unter CR auf dasselbe Niveau wie bei den Tieren unter AL. Die mitochondriale Membranfluidität verringerte sich im Cerebellum während des Alterns bei beiden Formen der Ernährung, allerdings bei den Tieren unter CR sogar stärker und bereits seit dem jungen Alter. Das Gewicht des Hippocampus, die mitochondriale Gesamtproteinmenge und die CI-Aktivität in einigen OxPhos-(Super-)Komplexen verringerten sich unabhängig von der Ernährung mit dem Altern, genauso wie die meisten analysierten Proteine unter AL und in jungen Tieren unter CR. Jedoch beim Altern unter CR stiegen die Proteinmengen sogar auf ein höheres Maß als bei den vergleichbaren AL Tieren an. Beim Altern unter AL veränderte sich die mitochondriale Membranfluidität nicht, aber bei den jungen und alten Tieren unter CR konnte eine verringerte Membranfluidität verglichen mit den Tieren unter AL festgestellt werden, obwohl sich sogar die Fluidität der Mitochondrienmembranen der jungen CR Tiere mit dem Altern etwas erhöhte. Die verringerte Fluidität könnte durch die erhöhte Proteinmenge erklärt werden oder einen erhöhten Cholesterinanteil und die damit verbundene Reaktion des Gewebes auf die verringerte CI Aktivität. Das Gewicht des Cerebrum verringerte sich mit dem Altern unabhängig von der Ernährung. Die Menge der OxPhos-Komplexe (exkl. CV) verringerte sich mit dem Altern unter AL aber unter CR erhöhte sich deren Menge. Die mitochondriale Membranfluidität verringerte sich unter dem Einfluss des Alterns und AL Fütterung, jedoch nicht unter CR. Die Fluidität der Membranen der CR gefütterten Tiere war stets höher als die der AL Tiere. Zusammengefasst verringerte das Altern das Hirngewebegewicht, die Gesamtproteinmenge und die Fluidität der Mitochondrienmembran von AL gefütterten Tieren. Die Menge der OxPhos-Komplexe und ihre Aktivität blieb größtenteils unverändert. Beim Altern unter CR erhöhte sich die Gesamtproteinmenge und die Membranfluidität verringerte sich, was im Zusammenhang mit gleichbleibenden CI- und CIV-Aktivitäten ein Teil von Kompensations-mechanismen zu sein scheinen. In Zusammenarbeit mit Dr. Koziel (IBA) wurden die Effekte des Alterns anhand eines Zellkulturmodells (HUVEC) analysiert. Hierin wurden die Einflüsse von NADPH Oxidase 4 (Nox4), ein Produzent von reaktiven Sauerstoffspezies, durch genetische Gen-Deaktivierung untersucht. Die Ergebnisse zeigten unter anderem, dass Nox4 für eine ver¬ringerte CI Menge und CI-Aktivität sorgte, was durch Gen-Deaktivierung umgekehrt wurde. Durch die Zusammenarbeit mit Dr. Kuter (IF-PAN) konnte ihr Modell der Parkinson Erkrankung in einem frühen Stadium analysiert werden. Die Effekte der Degeneration in Substantia nigra und Striatum von Wistar Ratten wurden beschrieben. Proteomanalysen umfassten die Identifikation der mitochondrialen Proteine durch PMF von 2D-BN/SDS Gelen, Quantifizierung der Proteinuntereinheiten durch die DIGE-Technik, CI- und CIV in-Gel Aktivitätstests und Messungen der Membranfluidität. Die Auswertungen sind noch in Bearbeitung. Teile der Daten wurden zur Veröffentlichung eingereicht und sind unter Begutachtung, weshalb unter Beachtung des Urheberrechts diese Daten in dieser Arbeit nicht beschrieben wurden.

URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-52173
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
600 Technology, medicine, applied sciences > 610 Medicine and health
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 09 Mar 2016 11:34
Last Modified: 09 Jul 2020 01:12
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5217
PPN: 386813825
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