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Nephrotoxicity biomarkers in vivo and in vitro: Identification and validation of biomarkers for the detection of substance-induced acute and sub-acute renal damage

Fuchs, Tobias Christian (2013)
Nephrotoxicity biomarkers in vivo and in vitro: Identification and validation of biomarkers for the detection of substance-induced acute and sub-acute renal damage.
Technische Universität
Ph.D. Thesis, Primary publication

Copyright Information: CC BY-NC-ND 2.5 Generic - Creative Commons, Attribution, NonCommercial, NoDerivs .

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Nephrotoxicity biomarkers in vivo and in vitro: Identification and validation of biomarkers for the detection of substance-induced acute and sub-acute renal damage
Language: English
Referees: Layer, Prof. Dr. Paul ; Warzecha, Prof. Dr. Heribert ; Hewitt, PhD Philip ; Laube, Prof. Dr. Bodo ; Harald, Prof. Dr. Kolmar
Date: 8 January 2013
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 7 March 2013

The major aims of this work included the evaluation of urinary protein markers, transcriptional analysis of the underlying mechanism of Vancomycin-induced nephrotoxicity based on gene expression analysis, the evaluation and generation of reliable transcriptional biomarkers. In addition, the utility of an in vitro test system to produce in vivo like responses to nephrotoxin treatment was tested. Therefore, several questions, important for the further enhancement of preclinical safety assessment as well as the understanding of the underlying mechanism of drug-induced nephrotoxicity, were addressed. For urinary biomarker analysis three well known nephrotoxins (Vancomycin, Cisplatin and Puromycin) were used. The urinary proteins Kim-1, Clusterin and Osteopontin were clearly identified as the most predictive biomarkers for tubular degeneration, while 2-microglobulin and Cystatin C can be used to discriminate glomerular induced proteinuria. In addition, exploratory urinary biomarkers like Timp-1, NGAL, Calbindin and VEGF showed great potential to deliver further information about the underlying mechanism of toxicity, the area of damage or potential gender differences. However, there are several limitations associated with these new markers and therefore, further investigations and improvements are still needed. The urine dipstick assay for Kim-1, as a quick and easy to use method, was compared to the multiplex Luminex assay. The data showed a clear limitation in sensitivity when there are only slight alterations in urinary Kim-1 levels. In cases where there are strong changes, the results showed a good correlation and can therefore be recommended as general screening tool. More traditional detection systems, in this case immunohistochemical analysis, can help the identification of early renal changes in a reliable way. This could be especially shown for Kim-1 and Clusterin, while the interpretation of renal expression of Osteopontin was hindered because of strong basal expression and therefore background staining. The transcriptomic analysis was performed primarily to obtain further insights into the underlying mechanism of Vancomycin-induced nephrotoxicity. Several potential key pathways and processes, which can be considered to be a good starting point for further investigations, were identified. For example, the inflammatory processes, characterized by an activation of the complement system, leukocyte extravasations and several processes involving the transcription factor NF-B, seems to play an important role in the nephritis induced by Vancomycin. In addition, a Fas-induced and caspase-dependent apoptosis was identified, which overlaps to the already mentioned inflammatory processes. The regenerative properties of the kidney, also reflected by the urinary protein biomarkers as well as almost all histo- and clinical-pathological observations, can be due to the important position of integrin-signaling and Rho-GTPase-induced actin remodeling. These processes lead to cellular shape restoration and cell migration. The hypothesis that transcriptional changes reflect renal (and other organs) pathological changes is well accepted. Therefore, a commercial test system provided by Compugen Ltd. (based on the measurement by SYBR® green detection of several specific genes, in combination with a related software tool) was tested for its predictive power. Three independent rat studies were chosen for this approach, namely Gentamycin, 3-pyrrolidineacetic acid, 5-[[[4_-[imino[(methoxycarbonyl) amino]methyl] [1,1_-biphenyl]-4-yl]oxy]methyl]-2-oxo-, methyl ester,(3S-trans) (FP007SE/ BI-3), and aristolochia acid. The results indicated a good reflection of Gentamycin induced nephrotxicity, while FP007SE and aristolochic acid delivered unclear results. Several animals within the FP007SE and aristolochic acid studies were identified as positive for renal insult, but without any histopathological correlation. Because of the time- and/or dose-dependent increase in incidence, it was hypothesized that a real prediction, i.e. identification of substance induced alteration with no manifested morphological changes, could be possible. Three published transcriptional biomarker lists (containing, 4 genes, 19 genes, and 45 genes) were evaluated for their potential to predict the outcome of our Vancomycin study. In addition, the methodological independence of such publicly available biomarker lists could be assessed. From these three gene lists a new “best predictor” biomarker list was created, by also taking the observations from the mechanistic gene expression analysis into account. This final list contains 40 individual transcripts which were grouped into 10 functional categories and reflect the biological reality in more detail. These can now be used in further exploratory or pre-clinical routine studies for the prediction of rodent specific nephrotoxicity. Finally, a proof-of-principal investigation was conducted with the aim to study whether or not a renal cell line (NRK-52E) can reflect transcriptional changes in a comparable way to those observed in rat in vivo after treatment with nephrotoxins. 192 Significantly altered genes were identified over all positive substances (AmphotericinB, Doxorubicin, Puromycin, and Paracetamol); where 44 genes (~23%) have been frequently reported in the literature to be associated with renal cell damage. Nine of these genes, including Cd44, Cyr61 and Cdkn1a, were of special interest since they were some of the most prominently deregulated in vivo genes and a possible mechanistic relation was identified within this study.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Das primäre Ziel dieser Arbeit umfasste die Evaluierung von urinären protein- und gewebebasierten transkriptionellen Biomarkern, die Analyse von Genexpressionsveränderungen zur näheren Charakterisierung des toxikologischen Mechanismus von Vancomycin und einen proof-of-principal Ansatz mit dem Ziel des Nachweises der Vergleichbarkeit von Genexpressionsveränderungen nach Behandlung mit Nephrotoxinen in der renalen Zelllinie NRK-52E und Nierengewebe der Ratte. In diesem Sinne konnten noch offene Fragen bezüglich der oben genannten Bereiche, welche sowohl für die weitere Verbesserung und Entwicklung von toxikologischen Sicherheitsbeurteilungen als auch für das Verständnis der zugrunde liegenden toxischen Mechanismen, beantwortet bzw. neue Lösungsansätze aufgezeigt werden. Für die Untersuchung der urinären Proteinbiomarker wurden drei gut beschriebene Nephrotoxine - nämlich Vancomycin, Cisplatin und Puromycin - verwendet. Die Proteine Kim-1, Clusterin und Osteopontin konnten über alle drei Studien als die prädiktivsten Biomarker für tubuläre Degenerationen identifiziert werden. Für glomeruläre Schäden war der Nachweis mit 2-microglobulin und Cystatin C am bedeutendsten. Weitere explorative urinäre Proteinbiomarker wie z.B. Timp-1, NGAL, Calbindin oder VEGF zeigten ebenfalls das Potential, weitere Informationen über den zugrunde liegenden Mechanismus, den Bereich der Schädigung innerhalb des Nephrons oder aber geschlechtsspezifische Reaktionen zu detektieren. Dies muss jedoch in weiteren Studien näher untersucht werden. Für die Messung der einzelnen Proteine wurde ein multiplexing immunoassay verwendet, welcher die parallele Detektion von mehreren Proteinen in einer Probe erlaubt, sowie ein Urinteststreifen für Kim-1, welcher als schnelle und einfache Methode evaluiert wurde. Das Ergebnis war eine limitierte Sensitivität, welche sich in kein bis geringen Änderungen des Urin-Kim-1 Levels bei leichten tubulären Veränderungen wiederspiegelte. Im Falle von starken tubulären Einflüssen waren die ermittelten Daten jedoch gut vergleichbar, womit durchaus eine Empfehlung zur Verwendung des Teststreifens als Standardanalyse gegeben werden kann. Zusätzlich zum Nachweis der Proteine im Urin wurden die drei prädikativsten Marker auch mittels immunohistochemischer Analysen evaluiert, mit dem Ergebnis, dass sowohl renal expremiertes Kim-1- und Clusterin-Protein zum frühen und spezifischen Nachweis von tubulären Schäden verwendet werden kann. Die Interpretation von renal expremiertem Osteopontin-Protein war durch die stärkere Hintergrundfärbung erschwert, aber dennoch möglich. Die transcriptomics-Analysen, welche u.a. zum Ziel hatten, den mechanistischen Hintergrund von Vancomycin-induzierten Nierenschäden, über den auf molekularer Ebene noch relativ wenig bekannt ist, zu untersuchen, lieferte mehrere potentiell wichtige Signalwege und Prozesse, welche in künftigen wissenschaftlichen Untersuchungen näher betrachtet werden sollten. So wurde der Einfluss von inflammatorischen Prozessen näher beschrieben. Charakteristische Mechanismen, welche als Schlüsselfunktion der Vancomycin-induzierten Nephritis identifiziert wurden, waren die Aktivierung des Komplementsystems und Leukozyten-Extravasation unter Beteiligung des Transkriptionsfaktors NF-B. Darüber hinaus konnte die Fas-vermittelte und Caspase-abhängige Apoptose näher charakterisiert werden, welche einige Parallelen zu den bereits erwähnten inflammatorischen Prozessen vermuten lässt. Die auffallende Regeneration des geschädigten renalen Gewebes nach behandlungsfreien Perioden konnte auf den Einfluss von Integrin-vermittelten Signalwegen zurückgeführt werden, welche unter Beteiligung von Rho-GTPasen in der Actin-Neubildung und -Umgestaltung involviert sind. Diese Prozesse führten zur Wiederherstellung der charakteristischen zellulären Form sowie der Wiederbesiedlung durch migrierende Zellen. Da die den Ergebnissen zugrunde liegenden Daten größtenteils auf Genexpressionsveränderungen beruhen, lässt sich dementsprechend keine finale Aussage über den Mechanismus machen. Es wurden jedoch mehrere wissenschaftlich gestütze Hypothesen aufgestellt, welche für weitere Untersuchungen als Anhaltspunkt in Betracht gezogen werden sollten. Im Gegensatz dazu ist die Verwendung von transkriptionellen Alterationen als Biomarker zur Reflextion von renalen pathologischen Veränderungen ohne weiteres möglich. Aus diesem Grund wurde zum einen ein Testsystem der Firma Compugen Ltd., basierend auf einer SYBR® green Messung von 6 Transkripten in Kombination mit einem Softwarepacket auf ihre Prädiktivität getestet. Drei unabhängige Rattenstudien unter Verwendung von Gentamycin, 3-pyrrolidineacetic acid, 5-[[[4_-[imino[(methoxycarbonyl) amino]methyl] [1,1_-biphenyl]-4-yl]oxy]methyl]-2-oxo-, methyl ester,(3S-trans) (FP007SE/ BI-3) und Aristolochiasäure wurden hierfür herangezogen. Es zeigte sich innerhalb der Gentamycin-Studie eine gute Übereinstimmung der histopothologischen Befunde mit den Ergebnissen des Testsystems, während innerhalb der FP007SE- und Aristolochiasäure-Studie ambivalente Resultate auftraten. Diese waren derart, dass einzelne Tiere als positiv affektiert eingestuft worden, ohne dass eine entsprechende Korrelation auf histopathologischer Ebene nachweisbar war. Da jedoch die Inzidenz mit der Zeit und/oder Dosis anstieg, konnte geschlussfolgert werden, dass es sich hierbei um eine Prädiktion von substanzinduzierten Veränderungen auf molekularer Ebene handelt, welche noch keine Ausprägung auf morphologischer Ebene hat. Zusätzlich zu diesem Ansatz wurden auf Basis der Genexpressionsdaten der Vancomycin-Studie, drei Transkriptbiomarkerlisten auf ihre Prädiktivität und methodische Souveränität hin untersucht. Auf Grundlage der Untersuchung und des Vergleiches dieser Listen, welche aus 4-, 19-, und 45 Genen bestand, sowie der Einbeziehung der Erkenntnisse aus den mechanistischen Analysen, konnte eine finale Biomarkerliste abgeleitet werden. Diese aus 40 Transkripten bestehende Liste wurde in 10 funktionale Kategorien unterteilt, um eine mechanistisch-toxikologische Ableitung zu ermöglichen. Diese so establierte Liste kann im Folgenden für weitere exploratorische oder aber präklinische Standardstudien verwendet und weiter optimiert werden. Eine proof-of-principal Analyse basierend auf einem in vitro Testsystem wurde durchgeführt mit dem Ziel, den Nachweis zu erbringen, ob die renale Zellinie NRK-52E vergleichbare Genexpressionsveränderungen nach Behandlung mit Nephrotoxinen aufweist, wie bei Verwendung von renalem Gewebe behandelter Ratten beobachtet wurde. Es konnten 192 signifikant veränderte Transkripte identifiziert werden, wobei 44 (~23%) dieser bereits häufig in der Literatur im Zusammenhang mit renalen zellularen Schäden in vivo erwähnt wurden. Für neun dieser Gene konnte eine besondere Evidenz aufgezeigt werden, da diese eine mechanistische Relation sowohl zueinander als auch der zugrunde liegenden Pathologie zuließen.

Uncontrolled Keywords: Toxikologie, Nierentoxizität, akutes Nierenversagen, Biomarkers, präklinische Entwicklung, Genexpressionsanalysen, Toxikogenomik, Zytotoxizität, Apoptose, Entzündungsreaktion, Gewebsregeneration, Vancomycin, Cisplatin, Puromycin, Paracetamol, Doxorubicin, Amphotericin B, Metformin, D-Mannitol
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
toxicology, nephrotoxicity, acute kidney injury, safety biomarker, preclinical development, in vitro, in vivo, cytotoxicity, Apoptosis, Inflammation, tissue recovery, geneexpression analysis, Toxicogenomics, Vancomycin, Cisplatin, Puromycin, Paracetamol, Doxorubicin, Amphotericin B, Metformin, D-MannitolEnglish
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-33841
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 500 Science
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
500 Science and mathematics > 590 Animals (zoology)
600 Technology, medicine, applied sciences > 610 Medicine and health
Divisions: Study Areas
10 Department of Biology
Date Deposited: 24 Apr 2013 13:26
Last Modified: 09 Jul 2020 00:19
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/3384
PPN: 386752559
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