TU Darmstadt / ULB / TUprints

Modification of biomaterials for the immobilization and release of chemokines

Kilb, Michelle Fiona (2023)
Modification of biomaterials for the immobilization and release of chemokines.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023641
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Modification of biomaterials for the immobilization and release of chemokines
Language: English
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja ; Kolmar, Prof. Dr. Harald
Date: 2023
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xii, 99 Seiten
Date of oral examination: 28 March 2023
DOI: 10.26083/tuprints-00023641

The presentation of biologically active molecules by modified biomacromolecules is of scientific interest for the understanding and treatment of inflammatory processes. The focus of this work lies on the presentation of chemokines to analyze chemokine-induced cell migration and on the characterization of photodynamically modified collagen biomaterials. In regenerative medicine, controlled drug release by modified biomaterials represents an important technique, as side effects due to systemic or excessive local drug applications can be avoided. Collagen is a commonly used biomaterial in regenerative medecine, as it provides a substrate for the adhesion of cells and is degraded to non-toxic products. Modifications of the biomaterial collagen by rose bengal and green light cross-linking (RGX) have already been described for different clinical applications, such as for orthopedics or ophthalmology. In this work RGX was used to bond stacks of different collagen materials to laminates with tailored properties for a biomedical application, e.g. a controlled drug release to avoid surgical site infections (SSIs). SSIs are the most common complications in orthopedic surgery and can be prevented by antimicrobial prophylaxis. The aim of this work was to characterize multilayered collagen laminates in terms of their swelling behavior and antibiotic release. For the fabrication of multilayered collagen laminates, two types of collagen materials were selected. The results indicated that homogeneous laminates composed of sponge-like collagen showed a lower swelling degree than a single RGX-treated, sponge-like collagen sheet. This was explained by the additional layer of rose bengal at the interface between the piled sheets. In contrast, homogeneous laminates composed of a thin collagen membrane did not show any change in their swelling degree, independent of the number of collagen layers. This was explained by the compact structure of the material. Heterogeneous collagen laminates composed of both materials reached swelling degree values in-between. For homogeneous sponge-like laminates and heterogeneous laminates the experimental swelling degrees were significantly smaller then the theoretical ones. These findings were explained by the different number of available swelling interfaces in laminates compared to individual sheets. To test the release of the model antibiotic vancomycin, an additively manufactured sample holder was developed, which allows to quantify the release of vancomycin into opposite directions. The sample holder elongated the time until half-maximal release was reached. This can be attributed to the decreased size of release areas compared to a sample in solution. Release experiments with heterogeneous, bi-layer collagen laminates under physiological conditions showed that the release of vancomycin preferentially takes place at the surface of a thin collagen film instead of sponge-like collagen, independent of the laminate’s orientation or loading. Furthermore, loading of vancomycin into the sponge-like collagen layer of heterogeneous, bi-layer collagen laminates led to an elongated time of half-maximal release. Studies with triple-layer collagen laminates led to similar results, as the time for half-maximal release increased with the number of sponge-like collagen layers. Furthermore, vancomycin was again preferentially released at the surface of the thin collagen film layer. These findings can be explained by shorter diffusion pathways and a negligible effect of re-swelling for the thin collagen film in contrast to the sponge-like collagen. In detail, the higher porosity results in a higher swelling degree. Compression by insertion of the sample into the sample holder therefore has a stronger effect on the sponge-like material and leads to a larger uptake of fluid during re-swelling that is opposed to the diffusion of vancomycin out of the collagen sheet. Consequently, vancomycin is released more slowly. In contrast to bi-layer laminates, the orientation of triple-layer heterogeneous laminates determined to which extent vancomycin was released by the thin collagen film layer. This can be explained by an increased swelling of sponge-like collagen at the bottom side of the sample holder. Similarly, an increased swelling and release at the bottom side of a triple-layer, sponge-like, homogeneous collagen laminate was observed. This can be attributed to the laminate's thickness. Overall, these findings reveal mechanisms that must be considered for the composition of collagen laminates. Since the pH can change during wound healing or infections, release studies under alkaline (pH 8.5) or acidic (pH 5.5) conditions reported for these processes were carried out. The pH did not have any effect on the total amount of released vancomycin from single sheets of RGX-modified, sponge-like collagen or heterogeneous, bi-layer laminates. The latter showed again a preferential release at the side of the thin collagen film layer, as observed for physiological pH (pH 7.4). In addition, the release from RGX-modified single sheets and bi-layer laminates was retarded at pH 5.5, which was explained by an increased swelling degree at this pH. At pH 8.5, the release was also delayed but no changes in the swelling degree were observed between pH 8.5 and pH 7.4. These results might be explained by electrostatic interactions, as negatively charged vancomycin might interact with positively charged areas of collagen at pH 8.5. The findings of this work can be used in regenerative medicine, as sponge-like collagen would be more suitable for a delayed release of active substances that support tissue regeneration. In summary, the results showed that the biomaterial collagen can be modularly assembled to laminates that allow a controlled and directed release of antibiotics. These findings are of biomedical interest, as sponge-like collagen may be more suitable for the delayed release of active substances at later stages of wound healing than for the fast release of antibiotics at infected sites. Further studies might include the release of proteins from collagen laminates or the cross-linking of proteins within collagen matrices with RGX for a delayed release. The second part of this work dealt with the presentation of biologically active molecules, such as chemokines on surfaces. These small secreted signaling proteins induce and steer the migration of cells in homeostatic and inflammatory processes. Chemokines interact with corresponding receptors on the surfaces of cells, induce different signaling cascades and lead to cellular responses, such as cell migration. The latter can either occur along soluble chemokine concentration gradients, which is specified as chemotaxis, or along surface-bound gradients, a process termed haptotaxis. As chemokines are also involved in different diseases, understanding the migration of cells upon chemokine stimulation contributes to understand and treat inflammatory processes. Interleukin-8 (CXCL8) was used as a model inflammatory chemokine in this work. In previous works, a dopamine-heparin coating had been developed that allowed a reversible immobilization of CXCL8 in microfluidic channels. In this work, reversibly immobilized CXCL8 gradients in microfluidic channels should be further characterized with respect to their suitability for different migration experiments. The results indicated that the dopamine-heparin coating led to a homogeneous distribution of CXCL8. Furthermore, the gradient stability at 37 °C was not different from previous experiments at room temperature. Cell migration experiments confirmed a directed and reproducible migration of THP-1 cells that express receptors for CXCL8 along the reversibly immobilized CXCL8 gradient towards high concentrations of CXCL8. Control experiments did not show any directed cell migration only in the presence of buffer or homogeneously distributed chemokine. Since chemokine gradients naturally occur as a mixture of soluble and immobilized gradients, the influence of overlaid, soluble chemokine on the gradient and cell migration was examined. An overlay of the gradient with soluble chemokine that has a concentration in the same order of magnitude as initial CXCL8 used for gradient formation increased the gradient's steepness within the first 20 h of incubation and led to a delay of cell migration. In contrast, very low concentrations of soluble CXCL8 overlaid over the immobilized gradient did not influence directed cell migration. In summary, the method represents a simple setup to analyze to which extent non-covalently immobilized chemokine gradients are influenced by soluble chemokine and enables a reproducible analysis of cell migration along these gradients. Since the coating method with dopamine and heparin only enables a non-covalent immobilization of CXCL8 that changed over the time of the migration experiment, it was attempted to covalently immobilize CXCL8 in microfluidic channels. The development of a suitable method was motivated by the fact that RGX worked well in the former project for cross-linking collagen layers and that collagen is a commonly used substrate in migration studies. However, no CXCL8 immobilization could be detected under the tested conditions. Interaction studies could not confirm an interaction of CXCL8 with collagen, while weak, non-specific interactions of RB with CXCL8 and BSA were observed. However, the interactions were apparently not sufficient to activate the protein for binding to collagen. As the immobilization of native proteins by a photodynamic process is attractive, future studies might involve the use of higher light intensities to develop an immobilization method.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Präsentation von biologisch aktiven Molekülen durch modifizierte Biomakromoleküle ist von wissenschaftlichem Interesse für das Verständnis und die Behandlung von inflammatorischen Prozessen. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Präsentation von Chemokinen zur Analyse der chemokininduzierten Zellmigration und der Charakterisierung von photodynamisch modifizierten Kollagenbiomaterialien. In der regenerativen Medizin stellt die kontrollierte Wirkstofffreisetzung durch modifizierte Biomaterialien ein wichtiges Thema dar, da Nebenwirkungen durch systemische oder zu hohe lokale Wirkstoffapplikationen verhindert werden können. Kollagen ist ein häufig verwendetes Biomaterial in der regenerativen Medizin, da es ein Substrat für die Adhäsion von Zellen darstellt und zu nicht-toxischen Produkten abgebaut wird. Modifikationen des Biomaterials Kollagen mittels Quervernetzung mit Bengalrosa und grünem Licht (RGX) wurden bereits für verschiedene klinische Anwendungen beschrieben, wie zum Beispiel für die Orthopädie und Augenheilkunde. In dieser Arbeit wurde RGX verwendet, um Stapel verschiedener Kollagenmaterialien zu Laminaten mit angepassten Eigenschaften für biomedizinische Anwendungen zu verbinden, z.B. eine kontrollierte Wirkstoffreisetzung zur Prävention von post-operativen Wundinfektionen (SSIs). SSIs stellen die am häufigsten vorkommenden Komplikationen in der orthopädischen Chirurgie dar und können durch antimikrobielle Prophylaxe verhindert werden. Ziel dieser Arbeit war es, mehrschichtige Kollagenlaminate bezüglich ihres Quellverhaltens und der Freisetzung eines Antibiotikums zu charakterisieren. Für die Herstellung mehrschichtiger Kollagenlaminate wurden zwei Arten an Kollagenmaterialien ausgewählt. Die Ergebnisse zeigten, dass homogene Laminate aus schwammartigem Kollagen ein niedrigeres Quellvermögen zeigten als eine RGX-behandelte, schwammartige Kollageneinzelschicht. Dies wurde durch die zusätzliche Schicht an Bengalrosa an der Grenzfläche zwischen den gestapelten Einzelschichten erklärt. Im Gegensatz dazu zeigten homogene Laminate aus einer dünnen Kollagenmembran keine Änderung des Quellvermögens, unabhängig von der Anzahl an Kollagenschichten. Dies wurde durch die kompakte Struktur des Laminats erklärt. Heterogene Kollagenlaminate, die aus beiden Materialien aufgebaut waren, erreichten dazwischenliegende Werte für das Quellvermögen. Für homogene Laminate aus schwammartigen Kollagen und heterogene Laminate war das experimentell bestimmte Quellvermögen signifikant kleiner als das theoretische. Diese Erkenntnisse wurden durch die unterschiedliche Anzahl an möglichen Quellungsgrenzflächen im Laminat gegenüber den einzelnen Schichten erklärt. Um die Freisetzung des Modellantibiotikums Vancomycin zu testen, wurde ein additiv gefertigter Probenhalter entwickelt, der es ermöglicht, die Freisetzung von Vancomycin in gegensätzliche Richtungen zu quantifizieren. Der Probenhalter verzögerte die Zeit, bis eine halbmaximalen Freisetzung erreicht wurde. Dies kann einer verringerten Freisetzungsfläche im Vergleich zu einer Probe in Lösung zugeschrieben werden. Freisetzungsversuche mit heterogenen, zweischichtigen Kollagenlaminaten unter physiologischen Bedingungen zeigten, dass die Freisetzung von Vancomycin bevorzugt an der Oberfläche eines dünnen Kollagenfilms statt eines schwammartigen Kollagens stattfindet, unabhängig von der Orientierung oder Beladung des Laminats. Darüber hinaus führte eine Beladung von Vancomycin in der schwammartigen Kollagenschicht von heterogenen, zweischichtigen Kollagenlaminaten zu einer verlängerten Zeit zur halbmaximalen Freisetzung. Studien mit dreischichtigen Kollagenlaminaten ergaben ähnliche Ergebnisse, da sich die Zeit für die halbmaximale Freisetzung mit der Anzahl an schwammartigen Kollagenschichten verlängerte. Des Weiteren wurde Vancomycin wieder bevorzugt an der Oberfläche der dünnen Kollagenfilmschicht freigesetzt. Diese Erkenntnisse können durch kürzere Diffusionswege und einem vernachlässigbaren Effekt des erneuten Quellens im Gegensatz zu schwammartigen Kollagen erklärt werden. Im Einzelnen ergibt sich aus der höheren Porosität ein höheres Quellvermögen. Kompression durch die Insertion der Probe in den Probenhalter hat demnach einen stärkeren Effekt auf das schwammartige Material und führt zu einer stärkeren Flüssigkeitsaufnahme während des erneuten Quellens, die der Richtung der Vancomycinfreisetzung aus der Kollagenschicht entgegen gerichtet ist. Damit wird das Vancomycin langsamer freigesetzt. Im Gegensatz zu zweischichtigen Laminaten, bestimmte die Orientierung von dreischichtigen, heterogenen Laminaten in welchem Ausmaß Vancomycin von der dünnen Kollagenfilmschicht freigesetzt wurde. Dies kann durch eine verstärkte Quellung des schwammartigen Kollagens an der unteren Seite des Probenhalters erklärt werden. In ähnlicher Weise wurde eine stärkere Quellung und Freisetzung an der unteren Seite eines dreischichtigen, schwammartigen, homogenen Kollagenlaminats beobachtet. Dies kann der Dicke des Laminats zugeschrieben werden. Insgesamt zeigen diese Befunde Mechanismen auf, die bei der Zusammensetzung von Kollagenlaminaten berücksichtigt werden müssen. Da sich der pH Wert während der Wundheilung oder Infektionen ändern kann, wurden Freisetzungsversuche unter alkalischen (pH 8,5) oder sauren (pH 5,5) Bedingungen durchgeführt, die für diese Prozesse beschrieben wurden. Der pH hatte keinen Einfluss auf die freigesetzte Gesamtmenge an Vancomycin aus RGX-modifiziertem, schwammartigen Kollagen oder heterogenen, zweischichtigen Laminaten. Letztere zeigten erneut eine bevorzugte Freisetzung auf der Seite der dünnen Kollagenfilmschicht, wie bei physiologischem pH (pH 7,4) beobachtet. Darüber hinaus war die Freisetzung aus RGX-modifizierten Einzelschichten und zweischichtigen Laminaten bei pH 5,5 verzögert, was mit einem erhöhtem Quellvermögen bei diesem pH erklärt wurde. Bei pH 8,5 war die Freisetzung ebenfalls verzögert, jedoch wurden keine Änderungen des Quellvermögens zwischen pH 8,5 und pH 7,4 beobachtet. Diese Ergebnisse könnten durch elektrostatische Interaktionen erklärt werden, da negativ geladenes Vancomycin mit positiv geladenen Bereichen des Kollagen bei pH 8,5 interagieren könnte. Die Erkenntnisse dieser Arbeit lassen sich in der regenerativen Medizin nutzen, da schwammartiges Kollagen besser für eine verzögerte Freisetzung von aktiven Substanzen geeignet wäre, welche die Geweberegeneration unterstützen. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse, dass das Biomaterial Kollagen modular zu Laminaten zusammengesetzt werden kann, welche eine kontrollierte und gerichtete Freisetzung von Antibiotika erlauben. Diese Erkenntnisse sind von biomedizinischem Interesse, da schwammartiges Kollagen eher für die verzögerte Freisetzung von aktiven Substanzen zu späteren Zeitpunkten der Wundheilung geeignet sein könnte als für die schnelle Freisetzung von Antibiotika an infizierten Stellen. Weitere Studien könnten die Proteinfreisetzung aus Kollagenlaminaten oder die Quervernetzung von Proteinen innerhalb von Kollagenmatrixen mittels RGX für eine verzögerte Freisetzung umfassen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte die Präsentation biologisch aktiver Moleküle, wie z.B. Chemokine auf Oberflächen. Diese kleinen Signalproteine induzieren und lenken die Migration von Zellen in homöostatischen und inflammatorischen Prozessen. Chemokine interagieren mit entsprechenden Rezeptoren auf den Oberflächen von Zellen, induzieren verschiedene Signalkaskaden und führen zu zellulären Antworten, wie zum Beispiel der Zellmigration. Letztere kann entweder entlang löslicher Chemokinkonzentrationsgradienten stattfinden, was als Chemotaxis bezeichnet wird, oder entlang oberflächengebundener Gradienten, ein Prozess der Haptotaxis genannt wird. Da Chemokine auch in verschiedenen Krankheiten involviert sind, ist das Verständnis der Migration von Zellen nach Chemokinstimulation eine Grundlage um inflammatorische Prozesse zu verstehen und zu behandeln. Interleukin-8 (CXCL8) wurde in dieser Arbeit als Modellchemokin verwendet. In vorherigen Arbeiten wurde eine Dopamin-Heparin-Beschichtung entwickelt, die eine reversible Immobilisierung von CXCL8 in mikrofluidischen Kanälen ermöglicht. In dieser Arbeit sollten reversibel immobilisierte CXCL8-Gradienten in mikrofluidischen Kanälen in Hinblick auf ihre Eignung für verschiedene Migrationsexperimente weiter charakterisiert werden. Die Ergebnisse zeigten, dass die Dopamin-Heparin-Beschichtung eine homogene Verteilung von CXCL8 ermöglichte. Darüber hinaus war die Gradientenstabilität bei 37 °C nicht anders als bei früheren Experimenten bei Raumtemperatur. Zellmigrationsexperimente bestätigten eine gerichtete und reproduzierbare Migration von THP-1-Zellen, die Rezeptoren für CXCL8 exprimieren, entlang des reversibel immobilisierten CXCL8-Gradienten zu hohen Konzentration an CXCL8 hin. Kontrollversuche zeigten keine gerichtete Zellmigration nur in der Anwesenheit von Puffer oder homogen verteiltem Chemokin. Da Chemokingradienten natürlicherweise als Mischung von löslichen und immobilisierten Gradienten auftreten, wurde der Einfluss von überlagertem, löslichem Chemokin auf den Gradienten und die Zellmigration untersucht. Eine Überlagerung des Gradienten mit löslichem Chemokin, dessen Konzentration in derselben Größenordnung liegt wie die des CXCL8, welches zur Gradientenbildung verwendet wurde, führte zu einer erhöhten Gradientensteilheit innerhalb der ersten 20 h der Inkubation und zu einer Verlangsamung der gerichteten Zellmigration. Im Gegensatz dazu hatten sehr niedrige Konzentrationen an löslichem CXCL8, das den immobilisierten Gradienten überlagerte, keinen Einfluss auf die gerichtete Zellmigration. Zusammenfassend stellt die Methode einen einfachen Aufbau dar, um zu analysieren, in welchem Ausmaß nicht-kovalent immobilisierte Chemokingradienten durch lösliches Chemokin beeinflusst werden und ermöglicht eine reproduzierbare Analyse der Zellmigration entlang dieser Gradienten. Da die Beschichtungsmethode mit Dopamin und Heparin nur eine nicht-kovalente Immobilisierung von CXCL8 ermöglicht, die sich über die Zeit des Migrationsexperiments verändert, wurde versucht, CXCL8 kovalent in mikrofluidischen Kanälen zu immobilisieren. Die Entwicklung einer geeigneten Methode war dadurch motiviert, dass RGX zur Quervernetzung von Kollagenschichten im ersten Projekt gut funktioniert hatte und Kollagen ein häufig verwendetes Substrat in Migrationsstudien ist. Unter den getesteten Bedingungen konnte jedoch keine CXCL8 Immobilisierung detektiert werden. Interaktionsstudien konnten keine Interaktion von CXCL8 mit Kollagen bestätigen, während schwache, unspezifische Interaktionen von RB mit CXCL8 und BSA beobachtet konnten. Die Interaktionen waren aber offenbar nicht ausreichend, um das Protein für eine Bindung ans Kollagen zu aktivieren. Da die Immobilisierung nativer Proteine durch einen photodynamischen Prozess attraktiv ist, könnten zukünftige Studien die Verwendung höherer Lichtintensitäten zur Entwicklung einer Immobilisierungsmethode beinhalten.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-236410
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie > Biologische Chemie
Date Deposited: 24 Apr 2023 12:06
Last Modified: 26 Apr 2023 06:09
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/23641
PPN: 507246861
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