Der kürzlich vorgestellte IPCC Bericht mahnt uns erneut zu einer Verstärkung der Ambitionen, eine nachhaltige Wirtschaft aufzubauen. Auch die UN betonen, dass der größte Teil der Wirtschaft noch nach einem linearen Modell funktioniert und dringend reformiert werden muss. Einen wertvollen Beitrag können biotechnologische Anwendungen leisten, da sie energieintensive Prozesse der chemischen Industrie ersetzen können. Zusätzlich haben sie den Charme, dass die eingesetzten Organismen nicht auf Erdölerzeugnisse angewiesen sind, sondern kostengünstige Energieträger aus industriellen Nebenerzeugnissen als Energiequelle nutzen können. Besonders die Ölhefe Yarrowia lipolytica entwickelt sich zu einem wertvollen Arbeitstier für die Industrie aber auch für die Wissenschaft. Leider steht für die Hefe bisher nur ein begrenztes Repertoire für das Metabolic Engineering oder für den Aufbau von Schaltkreisen in der synthetischen Biologie zur Verfügung. Durch die natürliche Anreicherung von Lipiden stellt die Hefe einen interessanten Produktionsorganismus für die Industrie dar. Diese Arbeit zielt unter anderem darauf ab, das Portfolio an SynBio Parts für diese Hefe zu erweitern. Dazu werden in chapter 3 Möglichkeiten vorgestellt, den Organismus weiter zu erschließen. So konnte eine Multiorganismen-Plasmid (section 3.3.1) entwickelt werden, das das schnelle Testen von Konstrukten in drei Organismen ermöglicht. Dieses Plasmid konnte dazu eingesetzte werden, ein Tetracycline Aptamer in Y. lipolytica zu testen (section 3.3.2). Das Aptamer wurde zuvor für Saccharomyces cerevisiae entwickelt und konnte dort erfolgreich für die Abschaltung der Translation verwendet werden. Y. lipolytica konnte erfolgreich mit einem Monomer des Aptamers modifiziert werden. Bedauerlicherweise war der Stamm, der das Aptamer trug, deutlich in ihrer Fitness beeinträchtigt. Dadurch war eine eindeutige Aussage, über die Funktionalität nicht möglich. Eine Erweiterung des Repertoires für Y. lipolytica und andere Organismen wurde durch die Etablierung von artifiziellen Landing-Pads verfolgt (section 3.3.3). Die Computer-generierten DNA-Sequenzen wurden so generiert, dass sie in den Organismen Bacillus subtilis, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae und Yarrowia lipolytica möglichst wenig Off-Target Effekte beim Einsatz von Cas9 hervorrufen. Dazu wurden in einer bis zu 900 bp langen Sequenz bis zu 25 artifizielle Protospacer aufgereiht. Diese konnten erfolgreich in das Genom der Organismen integriert werden. Als Proof-of-Concept dienten Versuche mit CRISPRi und CRISPRa, sodass durch die Adressierung unterschiedlicher Protospacer eine abgestufte Expressionsstärke erreicht wird, die sich nach dem Abstand zwischen Protospacer und Reportergen richtet. Eine fein abgestufte Aktivierung der Expression konnte in S. cerevisiae gezeigt werden. Durch den Einsatz von CRISPRa konnte die Basalaktivität des Minimalpromotors um das 3.4-fache gesteigert werden. In Y. lipolytica gab es keinen klaren Gradienten, wie in S. cerevisiae. Der Effekt von CRISPRi in B. subtilis war abhängig vom eingesetzten Promotor. Zur Unterstützung der molekularbiologischen und mikrobiologischen Arbeiten wurden Methoden zur Automation entwickelt (chapter 4). Durch einen klar erkennbaren „Edge-Effekt“ bei der Nutzung des Inkubators der CompuGene Robotics Plattform, wurde eine Methode entwickelt, die die Proben in den Mikrotiterplatten zufällig verteilt (section 4.4). Diese Methode kann zwar nicht den Randeffekt unterbinden, kann aber die Vergleichbarkeit zwischen den Proben verbessern. Außerdem konnte eine Möglichkeit entwickelt werden, um den Pipettierroboter aus der Automationsanlage zum Picken von Kolonien zu verwenden (section 4.5).