TU Darmstadt / ULB / TUprints

Generation of Multispecific Antibodies with Immune Cell Modulating Functions

Carrara, Stefania C. (2023)
Generation of Multispecific Antibodies with Immune Cell Modulating Functions.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00023023
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Generation of Multispecific Antibodies with Immune Cell Modulating Functions
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Hock, PD. Dr. Björn ; Peipp, Prof. Dr. Matthias
Date: 2023
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xvi, 169 Seiten
Date of oral examination: 12 December 2022
DOI: 10.26083/tuprints-00023023

Within the field of biologics, monoclonal antibodies have ruled the market with blockbuster and top selling drugs over the last decades. With the advancements in technological discoveries, lightspeed progress has been achieved to discover novel antibodies and mechanisms of action to address unmet needs and indications. Particularly, display technologies, in vitro systems, and high/ultra-high-throughput technologies have shown monumental progress to ensure the rapid discovery of novel biological entities.

In the first study presented herein, the focus laid on the generation of a bidirectional plasmid for recombinant antibody production in mammalian cells to facilitate native antibody folding and post-translational modifications. Conventional approaches for transient antibody production utilise co-transfection of heavy and light chain genes encoded on separate plasmids. Here, a single plasmid under the control of two independent promoters, constructed in a bidirectional fashion, is used. This study assessed promoter combinations resulting in the best antibody yields of two U.S. Food and Drug Administration (FDA)-approved antibodies, durvalumab and avelumab. By comparing promoters with varying strengths (CMV, minCMV, EF-1α and enhanced CMV), gene expression of heavy and light chain genes and subsequent IgG1 yields gave rise to the 2xeCMV combination, consisting of two mirrored eCMV cassettes controlling the expression of the light and heavy chains individually in each direction. This combination effectuated the most promising mRNA synthesis for both chains in two regularly used mammalian cell lines, human embryonic kidney 293 (HEK293) and Chinese hamster ovary (CHO) cells, and the highest yields after IgG quantification, comparable to the conventional co-transfection method. By substituting the co-transfection approach with this bidirectional plasmid, lower plasmid preparation efforts are required and further facilitates the handling of a higher number of mAb candidates simultaneously.

In the second study, the described bidirectional plasmid was put into practise by generating a Fab-presenting yeast surface display (YSD) library from immunised OmniRats. After screening of antibody formats via fluorescence-activated cell sorting (FACS), reformation of single candidates into their final IgG format is required, rapidly converting itself into a cumbersome step, and often resulting in the bottleneck to proceed with further characterisation. Within this study, a novel workflow based on Golden Gate Cloning (GGC) was established, allowing the bulk reformatting of antibody candidates after YSD FACS screening. By using an OmniRat-derived Fab library against MerTK, two screening rounds of YSD were performed by FACS. Subsequently, the antibody-encoding genes were transferred into a Mammalian_Destination (MD) vector, which contained a partial hinge-CH2-CH3 sequence, resulting in a full-length heavy chain after GGC with Esp3I. In order to produce the full-length variants, the yeast-specific Gal1,10 promoter was exchanged for the described promoter cassette combinations from the first study, 2xeCMV, by a final GGC step with BbsI. After assembly, the resulting MD vector contained the variable domains from the second sorting round with the respective constant domains required for the production of full-length IgG molecules. Next generation sequencing (NGS) of the screening rounds confirmed that the entire VH family diversity was covered in the resulting clones after bulk reformatting. Ten candidates were subsequently transiently expressed in mammalian cells and characterised for target binding and biophysical properties. This workflow presented a two-pot, two-step, PCR-free method to transition from YSD to a mammalian expression vector, eliminating any unwanted polymerase-introduced mutations and allowing for bulk cloning of yeast display-enriched antibody fragments. By this procedure, heavy and light chain pairing is conserved, contrary to other reformatting approaches, and paves the way to accelerate antibody hit discovery campaigns with YSD. Furthermore, this platform is malleable to other antibody formats and immunisation hosts, such as single chain variable fragments (scFvs) and chickens, and has the potential to be developed for bispecific or multispecific antibodies.

Next-generation antibodies, including bi- and multispecific antibodies, have been set under the spotlight for their ability to combine multiple modes of action simultaneously and result in higher efficacy, where monoclonal antibodies are lacking. A special class of such are immune cell engagers which target immune cells and tumour-associated antigens (TAAs) to create an immune synapse. Depending on the effector cell being targeted, specialised killing mechanisms are triggered to efficiently kill the targeted cells. Macrophage engagers are aimed at forcing targeted phagocytosis of the engaged cell type and have typically targeted the CD47/SIRPα axis up to date, known as the “do not eat me” signal. Nevertheless, targeting CD47 lacks specificity due to its ubiquitous expression pattern. On the other hand, T-cell engagers (TCEs) result in very specialised signals by targeting CD3 on T cells and additional TAAs. The hyperactivation of T cells results in a feedback loop through the activation of macrophages and the over-release of cytokines, resulting in cytokine storms or cytokine release syndrome (CRS). If left untreated, these can provoke life-threatening conditions. Thus, macrophage engagers and TCEs require novel cell-specific targets and widening of their therapeutic windows for restored patient alleviation.

In the third study within this cumulative thesis, the first bispecific macrophage engager targeting the receptor tyrosine kinase MerTK and epidermal growth factor receptor (EGFR) is presented. From the 10 antibody candidates derived in the second study, one candidate displayed agonistic properties, detected by the dose-dependent activation of the downstream signalling molecule phospho AKT (pAKT). MerTK’s overexpression on macrophages and tumour-associated macrophages within the tumour microenvironment (TME) lays the foundation to generate macrophage-engaging bispecific antibodies for targeted phagocytosis of tumour cells. Therefore, tandem biparatopic EGFR-binding VHH molecules (termed 7D9G) were combined in different architectures to generate bispecific molecules. By using the Knob-into-Hole technology, a bispecific with a MerTK-binding Fab arm and an EGFR-binding tandem VHH arm were generated, abolishing the agonistic properties of the parental MerTK mAb. On the other hand, a tetravalent bispecific antibody was generated by fusing the tandem VHHs to the C-terminus of the CH3 domain, resulting in intact MerTK-binding Fabs. The bispecific antibodies were able to bind both targets simultaneously in their soluble form and engage macrophages with EGFR+ tumour cells. Furthermore, they were able to compete with the binding site of EGF and therefore inhibit EGF-mediated signalling transduction by inhibiting pAKT. EGFR domain mapping of 7D9G by YSD resulted in binding to domain III of the extracellular EGFR domain, confirming its ligand-inhibiting abilities. Moreover, the bispecific antibodies resulted in targeted phagocytosis of EGFR+ tumour cells by macrophage-like THP-1 cells. This work represents the first bispecific macrophage-engager targeting MerTK for immuno-oncology applications by harnessing its expression and role in the tumour microenvironment to selectively phagocytise tumour cells.

In the last study presented here, a trispecific T-cell engager and cytokine release modulating antibody (TriTECM) was generated. In brief, a tetravalent, bispecific two-in-one antibody binding EGFR and PD-L1 simultaneously with a single Fab arm was combined with anti-CD3 and anti-IL-6R scFvs, derived from foralumab or sarilumab, respectively. By testing two TriTECM architectures varying mainly in the anti-CD3 scFv positioning and valency of IL-6R binding, tetraspecific molecules were generated with multiple mechanisms of action. Firstly, increased tumour specificity was ensured by targeting EGFR and PD-L1 with a low nanomolar on-cell affinity. Checkpoint inhibition by blockage of the PD-1/PD-L1 axis was mediated by binding to PD-L1. T-cell engagement and subsequent T-cell-mediated cytotoxicity was attenuated, resulting in reduced pro-inflammatory cytokine release. And lastly, inhibition of the IL-6/IL-6R pathway can modulate cytokine storms after T-cell activation. The attenuation of CD3 binding could allow existing CD3-binders to be used, that were previously shown to result in cytotoxicity. With cytokine release still putting obstacles in the way of novel immune cell engagers, TriTECM designs represent a novel class of therapeutics with the potential to inertly modulate over-activated immune responses and widen the therapeutic index of T-cell-engaging therapeutics.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Auf dem Gebiet der Biologika haben monoklonale Antikörper (mAb) in den letzten Jahrzehnten den Markt mit Blockbustern und umsatzstarken Medikamenten durchdrungen. Fortschritte bei der Entwicklung neuer Technologien gingen einher mit rasanten Fortschritten bei der Entdeckung neuartiger Antikörper und Wirkmechanismen, die es ermöglichen, neue Anwendungsgebiete zu erschließen. Insbesondere Display-Technologien, In-vitro-Systeme und Hoch- bzw. Ultra-Hochdurchsatz-Technologien ermöglichen heute die Isolierung von biologischen Wirkstoffkandidaten in relativ kurzen Zeiträumen.

In der ersten hier vorgestellten Studie lag der Schwerpunkt auf der Herstellung eines bidirektionalen Plasmids für die rekombinante Antikörperproduktion in Säugetierzellen, um die native Antikörperfaltung und posttranslationale Modifikationen zu erleichtern. Konventionelle Ansätze für die transiente Antikörperproduktion nutzen die Co-Transfektion von Genen der schweren und der leichten Kette eines Antikörpers, die auf separaten Plasmiden kodiert sind. In der vorgestellten Studie wird nur ein einziges Plasmid unter der Kontrolle von zwei unabhängigen Promotoren eingesetzt. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung, welche Promotorkombination die beste Antikörperausbeute für zwei von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen Antikörper, Durvalumab und Avelumab, erbringt. Durch die Kombination von Promotoren unterschiedlicher Stärke (CMV, minCMV, EF-1α und Enhanced CMV) für die Genexpression der schweren und leichten Kette, waren die IgG-Ausbeuten am höchsten bei der 2xeCMV-Kombination. Bei dieser wurden zwei gespiegelte eCMV-Kassetten eingesetzt, welche die Expression der leichten und schweren Kette individual in jeder Richtung steuerten. Diese Kombination bewirkte eine hohe mRNA-Syntheserate für beide Ketten in zwei standardmäßig eingesetzten Säugetierzelllinien und die höchsten Ausbeuten an Antikörpern, vergleichbar mit der herkömmlichen Co-Transfektionsmethode. Der Ersatz der Co-Transfektionsmethode bei Einsatz zweier Plasmide durch dieses bidirektionale Plasmid verringert den Aufwand für die Plasmidpräparation, was die gleichzeitige Bearbeitung einer größeren Anzahl von Antikörperkandidaten ermöglicht.

In der zweiten Studie wurde das zuvor beschriebene bidirektionale Plasmid verwendet, um eine Fab-Bibliothek aus immunisierten OmniRats zu generieren und die Fab-Varianten im Hefeoberflächendisplay (YSD) zu präsentieren. Nach der Durchmusterung von Antikörperkandidaten mittels fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) ist die Reformatierung einzelner Kandidaten in ihr endgültiges IgG-Format erforderlich, was mit größerem manuellem Aufwand verbunden ist und oft zu einer zeitlichen Verzögerung bei der weiteren Charakterisierung führt. Im Rahmen dieser Studie wurde ein neuartiger, auf Golden Gate Cloning (GGC)-basierender Arbeitsablauf etabliert, der die Massenreformatierung von Antikörperkandidaten nach dem YSD-FACS-Screening ermöglicht. Unter Verwendung einer von OmniRat stammenden Fab-Bibliothek gegen MerTK wurden zwei YSD-Durchmusterungsrunden mittels FACS durchgeführt. Anschließend wurden die Antikörper-kodierenden Gene in einen Mammalian_Destination (MD)-Vektor übertragen, der eine partielle Hinge-CH2-CH3 Sequenz enthielt, was nach einem GGC-Schritt mit Esp3I in einem ORF resultierte, welche die vollständige schweren Kette kodierte. Um die Volllängenvarianten zu erzeugen, wurde der hefespezifische Gal1,10-Promotor in einen abschließenden GGC-Schritt mit BbsI gegen die beschriebenen Promotorkassettenkombination aus der ersten Studie, 2xeCMV, ausgetauscht. Nach der Assemblierung enthielt der resultierende MD-Vektor die variablen Domänen aus der zweiten Sortierrunde mit den jeweiligen konstanten Domänen, die für die Produktion von IgG-Molekülen erforderlich sind. Next Generation Sequencing (NGS) aller Durchmusterungsrunden bestätigte, dass die gesamte Vielfalt der Sequenzen der VH-Familien in den resultierenden Klonen nach der Massenumformatierung wiedergefunden wurde. Zehn Kandidaten wurden anschließend transient in Säugetierzellen exprimiert und hinsichtlich ihrer Antigenbindung und biophysikalischen Eigenschaften charakterisiert. Dieser Arbeitsablauf ermöglicht einen direkten Transfer von Fab Fragmente kodierenden Genen aus einem Hefedisplayvektor in einen Säugetier-Expressionsvektor, vermeidet unerwünschte Polymerase-induzierte Mutationen und erlaubt eine Massenklonierung von angereicherten Antikörperfragmenten. Durch dieses Verfahren bleibt die Paarung von schwerer und leichter Kette im Gegensatz zu anderen Reformatierungsansätzen erhalten und ebnet somit den Weg zur Beschleunigung von Antikörper Durchmusterungskampagnen mit YSD. Darüber hinaus ist diese Plattform für andere Antikörperformate und Immunisierungswirte, wie scFvs und Hühner, anpassbar und hat das Potenzial, für bispezifische oder multispezifische Antikörper entwickelt zu werden.

Antikörper der neuesten Generation, einschließlich bi- und multispezifischer Antikörper, sind in den Fokus der Forschung gerückt, da sie mehrere Wirkmechanismen gleichzeitig kombinieren und eine höhere Wirksamkeit als monoklonale Antikörper erzielen können. Eine besondere Klasse von Antikörpern sind Immunzell-Engager, welche gleichzeitig Immunzellen und tumorassoziierte Antigene (TAAs) auf malignen Zellen targetieren, und so eine Immunsynapse schaffen. Je nach adressierter Immunzelle werden spezielle Effektorfunktionen aktiviert, was in der effizienten Tötung der targetierten Zellen resultiert. Makrophagen-Engager vermitteln eine gezielte Phagozytose der angegriffenen Zelle und adressierten bisher in dem meisten Fällen die CD47/SIRPα-Achse, welche für sogenannte "Friss mich nicht"-Signale verantwortlich ist. Allerdings wird CD47 ubiquitär exprimiert und ist daher nicht selektiv. T-Cell Engager (TCEs) hingegen erkennen zumeist CD3 auf T-Zellen und zusätzlich ein TAA auf einer Tumorzelle. Durch die Bildung einer immunologischen Synapse vermittelt der TCE die Aktivierung der T Zelle, was in einer zytotoxischen Reaktion gegen die Zielzelle resultiert. Die Hyperaktivierung von T-Zellen führt zu einer Rückkopplungsschleife durch die Aktivierung von Makrophagen und damit in der Folge zur übermäßigen Freisetzung von Zytokinen, was zu Zytokinstürmen oder einem Zytokinfreisetzungssyndrom führen kann, welche unbehandelt lebensbedrohlichen Zustände hervorrufen. Daher benötigen Makrophagen-Engager und TCEs neue, zellspezifische Targets und eine Erweiterung ihres therapeutischen Fensters, um das Auftreten von Nebenwirkungen im Patienten zu verhindern. In der dritten Studie, die im Rahmen dieser kumulativen Dissertation vorgestellt wird, wurde der erste bispezifische Makrophagen-Engager generiert, welcher den Rezeptor-Tyrosinkinase MerTK und den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) targetierte. Von den zehn Antikörperkandidaten, die in der zweiten Studie entwickelt wurden, zeigte ein Kandidat ein agonistisches Wirkprofil, welches durch die dosisabhängige Aktivierung eines nachgeschalteten Signalmoleküls, phospho-AKT, nachgewiesen wurde. Die Überexpression von MerTK auf Makrophagen und tumorassoziierten Makrophagen in der Tumormikroumgebung bildet die Grundlage für die Entwicklung von Makrophagen-aktivierenden bispezifischen Antikörpern zur gezielten Phagozytose von Tumorzellen. Daher wurden biparatopische EGFR-bindende tandem-VHH-Moleküle (bezeichnet als 7D9G) in verschiedenen Architekturen mit dem MerTK mAb kombiniert, um bispezifische Moleküle zu erzeugen. Mit Hilfe der „Knob-into-Hole“-Technologie wurde ein bispezifischer Antikörper designt, welcher mit einem Fab-Arm MerTK adressiert und ein weiterer Arm durch die EGFR-bindenden tandem-VHH dargestellt wurde. Dieses Konstrukt zeigte jedoch keine agonistische MerTK Bindung. Durch die Fusion der tandem VHHs an den C-terminus der CH3-Domäne des anti-MerTK IgGs, wurde die agonistische Bindungseigenschaft wiederhergestellt. Die bispezifischen Antikörper waren in der Lage, beide Zielmoleküle gleichzeitig in ihrer löslichen Form zu binden und Makrophagen mit EGFR-positiven Tumorzellen in Kontakt zu bringen. Darüber hinaus waren sie in der Lage, mit der Bindung von EGF, dem natürlichen Liganden von EGFR, zu kompetieren und somit die EGF-vermittelte Signaltransduktion durch Hemmung von phospho-AKT zu inhibieren. Des Weiteren führten die bispezifischen Antikörper zu einer gezielten Phagozytose von EGFR-positiven Tumorzellen durch makrophagenartige THP-1-Zellen. In dieser Arbeit wurde der erste bispezifische Makrophagen-Aktivator generiert, welcher MerTK adressiert und für immunonkologische Anwendungen geeignet ist, indem er dessen Expression und Rolle in der Mikroumgebung des Tumors für die selektive Phagozytose von Tumorzellen nutzt.

In der letzten hier vorgestellten Studie wurde ein trispezifischer T-Cell Engager und Zytokinfreisetzungs-modulierender Antikörper (TriTECM) entwickelt. Hierzu wurde ein tetravalenter bispezifischer Zwei-in-Eins-Antikörper, der EGFR und PD-L1 gleichzeitig mit einem einzigen Fab-Arm bindet, mit Anti-CD3- und Anti-IL-6R-Einzelketten-Variablen-Fragmenten (scFvs) kombiniert, welche von Foralumab bzw. Sarilumab abgeleitet wurden. Es wurden zwei TriTECM-Architekturen erzeugt, die sich hauptsächlich in der Positionierung der Anti-CD3-scFvs und der Valenz der IL-6R-Bindung unterschieden, welche mehreren Wirkmechanismen vereinten. Zunächst wurde eine erhöhte Tumorspezifität gewährleistet, indem EGFR und PD-L1 mit einer niedrigen nanomolaren Affinität auf doppelt-positive Zielzellen gebunden werden. Durch Bindung an PD-L1 wurde die PD-1/PD-L1-Achse blockiert und dieser Immuncheckpoint inhibiert. Die T-Zell-Bindung und die anschließende T-Zell-vermittelte Zytotoxizität wurden abgeschwächt, was zu einer verringerten Freisetzung von pro-inflammatorischen Zytokinen führte. Abschließend kann die Hemmung des IL-6/IL-6R-Signalwegs die Zytokinausschüttung nach der T-Zell-Aktivierung herunterreguliert. Die Abschwächung der CD3-Bindung könnte es ermöglichen, Literatur-bekannte CD3-Binder zu verwenden, die zuvor nachweislich Zytotoxizität bewirkten. Angesichts der Tatsache, dass die Freisetzung von Zytokinen immer noch eine Problematik bei der Entwicklung neuartiger Immunzellen-targetierender Antikörper darstellt, sind TriTECM eine neue Klasse von Therapeutika, die das Potenzial haben, überaktivierte Immunantworten gezielt zu modulieren und den therapeutischen Index von T-Zell-aktivierenden Therapeutika zu erweitern.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-230236
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 06 Feb 2023 13:15
Last Modified: 07 Feb 2023 08:24
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/23023
PPN: 504377663
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