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The role of fungal secondary metabolites in Collembola ― fungi interactions

Staaden, Swantje (2010)
The role of fungal secondary metabolites in Collembola ― fungi interactions.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication

Dissertation Staaden - PDF (PDF)
Copyright Information: CC BY-NC-ND 2.5 Generic - Creative Commons, Attribution, NonCommercial, NoDerivs .

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: The role of fungal secondary metabolites in Collembola ― fungi interactions
Language: English
Referees: Scheu, Prof Stefan ; Brose, Prof Ulrich
Date: 29 July 2010
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 14 June 2010

SUMMARY Soil organisms, in particular fungi and decomposer insects are primary drivers of organic matter recycling and energy fluxes (Swift et al. 1979; Cadish and Giller 1997; Bardgett et al. 2005). Fungi play a crucial role in the cycling of carbon, nitrogen and phosphorus in terrestrial ecosystems functioning while having to deal in the same time with relentless attacks from fungivores. Only few studies, however, investigated the structuring forces of the population dynamics of fungi and the abundant decomposer fungivores, such as Collembola, with whom they continuously interact. This thesis investigated the interactions between fungi and Collembola focussing particularly on the effects of fungal secondary metabolites from different perspectives. Fungal secondary metabolites are believed to be one of the main vectors driving this interaction. Aiming to get specific insights into the nature of the mechanisms driving this interaction I focused on testing three overarching hypothesis: H1. Fungal secondary compounds mediate the Collembola – fungi interaction H2. Collembola have evolved means to detect fungal toxicity H3. Genetic evidence (transcript regulation) can be used to understand the molecular nature of the Collembola – fungi interaction The above three overarching hypothesis have been addressed in three experimental studies, each with several pointed hypothesis. H1. The first experimental study consisted of a feeding choice experiment offering single and mixed fungal diets using labelled fungal species (C3 and C4; 13C and 15N) of different toxicity. Collembola fractionation and carbon/ nitrogen incorporation of fungal species were assessed via stable isotope analysis. Four knock out mutants of Aspergillus nidulans with the sterigmatocystin production blocked at different steps along the biosynthetic pathway were combined in mixed diets with either the high quality fungus Cladosporium cladosporioides or the low quality fungus A. nidulans (wildtype). This study aimed at understanding the impact of fungal secondary metabolites and more specifically sterigmatocystin (ST) on Collembola performance in single and mixed diets and stabile isotope fractionation. It was hypothesised that (i) presence of sterigmatocystin (ST) impairs Collembola performance with increasing fungal toxicity of the A. nidulans strains, (ii) mixed diets will be beneficial to Collemboal fitness due to toxin dilution and (iii) the fractionation of 13C and 15N it is more pronounced in more toxic diets. We found that ST generally but not uniformly diminished springtail SUMMARY v fitness partially supporting the idea that secondary compounds act as shield against fungivory. However, the use of knockout mutants A. nidulans of the ST pathway (S3-S6) led to rather idiosyncratic responses. Although Collembola fitness was not uniformly increased in mixed diets (suggesting a species specific response) the results still support the toxin dilution hypothesis since no correlation between fungal N content and ingestion could be found. Strong and specific responses of the two Collembola species to mixed diets, knock out mutants and toxins suggest the evolution of species specific strategies to cope with the constraints associated with living in different soil layers. The hypothesis suggesting a link between stable isotope fractionation and fungal toxins has been partially supported with the results suggesting that fungal toxin content may be more important than the nutrient content in controlling stable isotope fractionation of 13C and 15N. H2. The second study focused on the olfactory ability of Collembola to perceive fungal toxicity via olfactory/volatile cues. By means of an olfactometer approach this experiment hypothesized that (i) Collembola are able to olfactorily perceive and distinguish fungal species/strains differing in secondary metabolism, (ii) that Collembola are able to sense and respond to fungal grazing by avoiding to forage on grazed fungi and that (iii) grazing by Collembola triggers in secondary metabolite gene expression in one Basidiomycete and one Ascomycete fungal species using a custom made cDNA microarrays (Chapter 3). All investigated Collembola species recognized fungal olfactory cues and directed their movement to fungal patches and moreover towards fungal strains with suppressed secondary metabolites, in particular towards the mutant ΔlaeA with the main part of secondary metabolites silenced. The volatile cues of conspecifically grazed fungi provoked a movement from two of the three Collembola species (H. nitidus and S. furcifera) towards ungrazed fungi. However, the response of S. furcifera was restricted to fungi extensively exposed to grazing (5 days) suggesting that the response varies between Collembola species. Surprisingly, the investigated fungal gene spectrum did not significantly respond to grazing by Collembola. The results support the first and second hypothesis indicating that Collembola are able to olfactorily differentiate fungi of different toxicity, orientate their movement towards more palatable fungi and avoid movement towards fungi previously exposed to grazing. The lack of changes in fungal gene regulation by grazing suggests that refined methods need to be adopted to investigate the genetic response of fungi to grazing. SUMMARY vi H3. The third study investigated the impact of fungal secondary metabolites on transcript regulation of stress related expressed sequence tags (ESTs) of Folsomia candida, the Collembola species used as model species in ecotoxicology. Aspergillus nidulans wildtype (WT; Ascomycota) able to produce secondary metabolites including sterigmatocystin (ST) and a knockout mutant with reduced secondary metabolism (A. nidulans ΔLaeA) were combined with the high quality fungus C. cladosporioides as mixed diets or offered as single diets. I hypothesized that (i) A. nidulans WT triggers more genes associated with stress responses compared to the A. nidulans ΔlaeA strain with suppressed secondary metabolism, (ii) C. cladosporioides causes significantly different transcript regulation than the A. nidulans strains ΔlaeA and WT, and (iii) mixed diets will cause significantly different transcript expression levels than single diets. All three hypotheses are generally supported despite the fact that many functions of the affected ESTs are unknown. The results bring molecular evidence for the existence of a link between fungal secondary metabolites and responses in springtails supporting the hypothesis that fungal secondary metabolites act as a shield against fungivory. Overall, the work conducted in this thesis suggests that fungal secondary metabolites act as a structuring force in Collembola-fungi interactions and population dynamics. Using multiple approaches (food choice, olfactory and genetical) the results brings new insights supporting the hypothesis that fungal secondary metabolites act as a shield against fungivory.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

ZUSAMMENFASSUNG Bodenorganismen, insbesondere Pilze und Mikroarthropoden bilden treibende Kräfte für die Wiederaufbereitung organischen Materials und beeinflussen hierdurch die Energieflüsse terrestrischer Ökosysteme. Pilze unterliegen einer Vielfalt antagonistischer Einflüsse, z.B. werden sie von Pilzfressern konsumiert. Potenzielle Abwehrmechanismen gegen Fraßfeinde, wie die im Boden häufig vorkommenden Collembolen, sind dabei wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Sekundärmetaboliten von Pilzen auf Collembolen untersucht. In Analogie zu den detailliert untersuchten Wechselwirkungen zwischen Pflanzen und Herbivoren wurde angenommen, dass pilzliche Sekundärmetabolite eine wichtige Rolle für die Abwehr von Fraßfeinden spielen. Es wurden drei übergreifende Hypothesen untersucht: H1. Sekundärmetabolite spielen eine wichtige Rolle in der Kommunikation zwischen Collembolen und Pilzen. H2. Collembola detektieren olfaktorische Signale der Pilze, pilzliche Toxizität und modifizieren ihr Verhalten. H3. Pilzliche Sekundärmetabolite in der Nahrung von Collembolen veränderen deren Genexpression, was in Transkriptanalysen detektiert werden kann. Zur Untersuchung dieser Hypothesen wurden drei experimentelle Studien durchgeführt. H1. Das erste Experiment untersuchte den Einfluss pilzlicher Sekundärmetabolite auf Reproduktionsparameter von Collembolen. Verfüttert wurden Einzel- und Mischdiäten bestehend aus Pilzarten/-stämmen verschiedener Toxizität, die mit stabilen Isotopen markiert waren (13C und 15N). Vier toxindefiziente knock out Mutanten von Aspergillus nidulans, eine regulatorische mit ausgeschalteter Sterigmatocystinproduktion und drei funktionale biosynthetische Vorstufen, wurden in einem Fütterungsexperiment als Einzelund Mischdiäten eingesetzt. Der von Collembolen aufgenommene Kohlenstoff einzelner Pilze in Mischdiäten wurde durch den Einbau von stabilen Isotopen verfolgt. Die Untersuchung diente einem tieferen Verständnis der Bedeutung pilzlicher Sekundärmetabolite, insbesondere Sterigmatocystin, für die Fitness von Collembolen. Zudem wurde die Fraktionierung von stabilen Isotopen in Abhängigkeit pilzlicher Sekundärmetabolite in der Nahrung analysiert. ZUSAMMENFASSUNG viii Es wurde angenommen, dass (i) die Präsenz von Sterigmatocystin und seiner Vorstufen in Mutanten von A. nidulans die Fitness von Collembolen beeinträchtigt, (ii) sich Mischkost durch Verdünnung toxischer Subtanzen vorteilhaft auf die Fitness von Collembolen auswirken, und dass (iii) die Fraktionierung von 13C und 15N im Gewebe von Collembolen mit steigender Toxizität der Pilzstämme zunimmt. Tatsächlich veränderte Sterigmatocystin die Fitness der Collembolen, wobei die toxische Wirkung allerdings nicht parallel zu knockout Mutanten mit vermindertem Sekundärstoffwechsel abnahm. Die Hypothese, dass Mischdiäten zu einer Verdünnung von Toxinen führen, wurde generell bestätigt, wobei die untersuchten Collembolenarten jedoch unterschiedlich reagierten. Insgesamt weisen die Ergebnisse auf artspezifische Anpassungen von Collembolen an pilzliche Toxine hin. Die Hypothese, dass die Fraktionierung stabiler Isotope (13C und 15N) von pilzlichen Toxinen abhängt, wurde teilweise bestätigt. Die Ergebnisse deuten daraufhin, dass pilzliche Toxine für die Fraktionierung stabiler Isotope von größerer Bedeutung sind als der Gehalt von Nährstoffen. H2. Das zweite Experiment untersuchte die Fähigkeit von Collembolen, Toxizität von Pilzen durch olfaktorische Signale wahrzunehmen. In separaten Ansätzen wurden die folgenden Hypothesen geprüft: (i) Collembolen erkennen Pilzarten/–stämme mit variierendem Sekundärmetabolitgehalt olfaktorisch, (ii) Collembolen differenzieren zwischen Pilzen, die von Artgenossen befressen wurden, und nicht zuvor attackierten Pilzen, und (iii) Fraß von Pilzen durch Collembolen verändert die Transkription pilzlicher Sekundärmetabolite in Ascomycota (A. nidulans) und Basidiomycota (Laccaria bicolor). Collembolen nahmen olfaktorische Signale von Pilzen wahr, was sich in veränderter Bewegungsrichtung äußerte. Sie bevorzugten dabei Pilzstämme mit vermindertem Gehalt von Sekundärmetaboliten, insbesondere A. nidulans ΔLaeA mit stark reduziertem Sekundärmetabolitanteil. Olfaktorische Signale von Pilzen, die von Artgenossen befressen worden waren, veränderten das Wahlverhalten bei zwei der drei getesteten Collembolaarten (Heteromurus nitidus und Supraphorura furcifera), wobei die Tiere den unbefressenen Pilz bevorzugten. Jedoch trat die Bevorzugung bei S. furcifera nur bei zuvor intensiv befressenen Pilzen auf, was wiederum für eine artspezifische Reaktion bei Collembolen spricht. Erstaunlicherweise wurde durch Fraß von Collembolen keine signifikante Änderung der Genexpression in A. nidulans und L. bicolor festgestellt, was allerdings auf methodische Limitierung zurückzuführen sein könnte. Insgesamt stützen die ZUSAMMENFASSUNG ix Ergebnisse die erste und zweite Hypothese, was darauf hindeutet, dass das olfaktorische System von Collembolen in der Lage ist, Pilze entsprechend ihrer Toxizität zu differenzieren. Collembolen meiden zudem bereits befressene Pilze, was auf induzierte Abwehrsubstanzen in den Pilzen hindeutet. H3. Das dritte Experiment untersuchte den Einfluss pilzlicher Sekundärmetabolite auf die Transkriptregulation eines Spektrums von Gensequenzen (ESTs) von Folsomia candida, einem Modellorganismus in der Ökotoxikologie. Der Wildtyp von A. nidulans (WT) mit vollständig exprimiertem Sekundärmetabolismus, einschließlich Sterigmatocystin (ST), die knock out Mutante A. nidulans ΔLaeA mit reduziertem Sekundärmetabolitanteil und der Referenzorganismus Cladosporium cladosporioides wurden in einem Fütterungsexperiment als Einzel- oder als Mischkost angeboten. Es wurde angenommen, dass (i) A. nidulans WT mit hohem Toxinanteil die Transkription von stressassoziierten Genen in F. candida stärker beeinflusst als A. nidulans ΔLaeA mit stark reduzierter Toxinbildung, dass (ii) C. cladosporioides die Transkription von Genen in F. candida weniger beeinflusst als die A. nidulans Stämme ΔLaeA and WT und, dass (iii) Mischdiäten verglichen mit Einzeldiäten andere Expressionsmuster verursachen. Alle drei Hypothesen wurden generell unterstützt trotz der meist unbekannten Funktion der regulierten ESTs. Die Ergebnisse geben Hinweise auf die molekulare Wirkungsweise von pilzlichen Sekundärmetaboliten in Collembolen. Die Ergebnisse deuten damit auf evolutive Anpassungsmechanismen von Collembolen auf pilzliche Toxine hin. Insgesamt bestätigen die Experimente die Hypothese, dass pilzliche Sekundärmetabolite als strukturierende Kraft in Collembolen-Pilz Wechselbeziehungen fungieren. Collembolen können den pilzlichen Sekundärstoffwechsel beeinflussen, wohingegen Pilze über konstitutive und induzierte Abwehrsubstanzen den Metabolismus und Lebenszyklus von Collembolen verändern. Die Verwendung von unterschiedlichen Methoden (stabile Isotopenanalyse, Verhaltenstests zur olfaktorischen Wahrnehmung und molekulare Analyse der Genexpression) erlaubte neue Einblicke in die Wechselbeziehung zwischen Pilzen und Pilzfressern. Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass pilzliche Sekundärmetabolite zur Abwehr von Fraßfeinden evolviert sind. Dies deutet auf kooevolutionäre Prozesse zwischen Pilzen und Collembolen als Pilzfresser hin.

URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-22451
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology > Ecoinformatics and computational ecology
Date Deposited: 30 Jul 2010 07:39
Last Modified: 07 Dec 2012 11:58
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/2245
PPN: 226570320
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