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Immunological characterization of Man2 as a novel adjuvant and rFlaA:Betv1 as a therapeutic candidate for allergy treatment

Lin, Yen-Ju (2022):
Immunological characterization of Man2 as a novel adjuvant and rFlaA:Betv1 as a therapeutic candidate for allergy treatment. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00022284,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Immunological characterization of Man2 as a novel adjuvant and rFlaA:Betv1 as a therapeutic candidate for allergy treatment
Language: English
Abstract:

Type I hypersensitivity disorders are caused by exaggerated Th2-biased, IgE-mediated inflammatory reactions against harmless environmental allergens. The treatment options for type I allergies are limited, and “allergen vaccination,” or allergen-specific immunotherapy (AIT), is currently the only method to re-establish immunological tolerance towards the respective allergens. AIT is performed by repeated administration of allergen extracts shifting allergen-specific Th2 responses towards Th1 responses. However, AIT consists of long treatment schedules, has the risk of inducing anaphylactic side effects, and partially has a low efficacy due to weakly immunogenic allergen molecules. Therefore, novel adjuvants need to be developed for either enhancing or modifying the overall immune responses in AIT. This thesis aimed to evaluate the immune-modulating capacity of (1) β-(1→4)-mannobiose (Man2) as a novel adjuvant on myeloid dendritic cells (mDCs), and the new therapeutic candidate (rFlaA:Betv1, consisting of Listeria monocytogenes flagellin A fused to the major birch pollen allergen Bet v 1) on either (2) epithelial cells or (3) macrophages for type I allergy treatment. 1) The present results have shown that Man2 could induce a mainly “Toll”-like receptor 4 (TLR4)- and partially complement C3a receptor (C3aR)-dependent production of inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-β, and IL-10) and the upregulation of co-stimulatory molecules (CD40, CD80, and CD86) on mDCs. Besides, Man2 activated mitogen-activated protein kinase (MAPK)-/ nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB)-pathways, and triggered the Warburg Effect in mDCs. Finally, Man2-stimulated mDCs enhanced antigen-specific, T cell-derived IL-2 production, demonstrating that Man2 has potential as a vaccine adjuvant. 2) In our group´s previous studies, rFlaA:Betv1 was shown to induce mDCs activation, but its effects on other cell types remained unknown. The data presented in this thesis demonstrated, that rFlaA:Betv1 could induce a MAPK- and NFκB-dependent, but TLR5-independent secretion of CCL2, CCL20, and IL-6 from lung epithelial cells. Additionally, rFlaA:Betv1 induced a p38-MAPK and cyclooxygenase 2 (COX2)-dependent prostaglandin E2 (PGE2) production from epithelial cells, which could modulate mDC responses by decreasing their IL-12- and TNF-α-production. Therefore, epithelial cells also contribute to the immune-modulating capacity of rFlaA:Betv1, by modulating the responses of antigen-presenting cells (APCs). 3) Besides DCs, macrophages are another important type of APC. This thesis demonstrated, that macrophages could also be activated by rFlaA:Betv1 stimulation. Here, rFlaA:Betv1 induced a Myeloid differentiation primary-response protein 88 (MyD88)-, Jun N-terminal kinases (JNK)-MAPK-, and partially TLR5-dependent inflammatory cytokine secretion as well as a Warburg Effect from bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Furthermore, using RNA-Seq and Western Blot analyses, the upregulation of Janus kinase (JAK)-signal transducer and activator of transcription (STAT)-transcription factor hypoxia-inducible factor 1 α (HIF-1α) signaling was identified, which confirmed results from Seahorse Extracellular Flux technology showing, that rFlaA:Betv1 triggered a pronounced metabolic shift towards glycolysis in BMDMs. Finally, rFlaA:Betv1-stimulated BMDMs could suppress the secretion of Th2 cytokines from Bet v 1-specific, Th2-biassed CD4+ T cells while increasing both Th1- and anti-inflammatory cytokine secretion. In summary, the publications presented in this thesis demonstrated that Man2 could be an attractive novel adjuvant, and rFlaA:Betv1 can be an effective therapy for type I allergy treatment. The results in this thesis may contribute to the future development of safe and effective vaccines and therapeutics.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Typ I Allergien zählen zu den Hypersinsitivitätserkrankungen. Sie werden durch überschießende, Th2-basierte und IgE-vermittelte Entzündungsreaktionen verursacht, die sich gegen harmlose Allergene aus unserer Umwelt richten. Die Behandlungsmöglichkeiten für Typ-I-Allergien sind momentan begrenzt, wobei die Allergen-spezifische Immuntherapie (AIT) derzeit die einzige Methode zur Wiederherstellung der immunologischen Toleranz gegenüber den betreffenden Allergenen ist. Während der AIT werden wiederholt Allergenextrakten verabreicht, welche die Allergen-spezifischen Th2-Reaktionen in Richtung Th1-Reaktionen verschieben sollen. Jedoch stellen sich auch bei der AIT einige Herausforderungen: es ergeben sich lange Behandlungszeiten, es besteht das Risiko anaphylaktischer Reaktionen als eine der möglichen Nebenwirkungen und die Wirksamkeit kann aufgrund der schwachen Immunogenizität der Allergene variieren. Um diese Probleme zu lösen müssen neuartige Adjuvantien und Therapeutika entwickelt werden, welche die induzierte Immunantwort bei der AIT entweder verstärken oder modifizieren. In der vorliegenden Arbeit wurde sowohl die immunmodulierende Wirkung von (1) β-(1→4)-Mannobiose (Man2) als neuartiges Adjuvans auf myeloiden dendritischen Zellen (mDCs) getestet als auch, die Wirkung des Fusionsproteins rFlaA:Betv1 (bestehend aus dem Listeria monocytogenes Flagellin A, welches mit dem Birkenpollen-Hauptallergen Bet v 1 fusioniert wurde) (2) zum einen auf Epithelzellen und (3) zum anderen auf Makrophagen untersucht. Dieses soll zur Behandlung von Typ-I-Allergien eingesetzt werden. 1) In der beigefügten Publikation konnte gezeigt werden, dass Man2 die Produktion von Zytokinen (IL-6, TNF-α, IL-1β, IFN-β und IL-10) und die Expression von co-stimulatorischen Molekülen (CD40, CD80 und CD86) auf mDCs induziert. Diese Form der Aktivierung wurde als vorrangig "Toll"-like Rezeptor 4 (TLR4)- und teilweise C3a-Rezeptor (C3aR)-abhängig identifiziert. Zudem aktivierte Man2 in mDCs die mitogen-activated protein kinase (MAPK)-/ nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFκB)- abhängigen Signaltransduktionswege und induzierte den Warburg-Effekt. Des Weiteren konnten mDCs, welche mit Man2 stimuliert wurden, die Antigen-spezifische IL-2-Produktion von T-Zellen steigern. Hieraus lässt sich schließen, dass Man2 als Adjuvans für Impfstoffe Potential besitzt. 2) In vorhergegangenen Studien unserer Gruppe konnte gezeigt werden, dass rFlaA:Betv1 mDCs aktivieren kann, während die Auswirkungen auf andere Zelltypen bisher unerforscht war. Die Daten dieser Arbeit konnten zeigen, dass rFlaA:Betv1 in Lungenepithelzellen eine MAPK- und NFκB-abhängige, aber TLR5-unabhängige Sekretion der Chemokine CCL2, CCL20 und des Zytokins IL-6 induzieren kann. Die Stimulation mit rFlaA:Betv1 löste in den Epithelzellen eine p38-MAPK- und Cyclooxygenase 2 (COX2)-abhängige Prostaglandin E2 (PGE2)-Produktion aus, welche die Immunantwort von mDCs veränderte: es wurden geringere Mengen IL-12- und TNF-α ausgeschüttet. Hieraus lässt sich schließen, dass Epithelzellen zur immunmodulierenden Wirkung von rFlaA:Betv1 beitragen, indem sie die Reaktionen Antigen-präsentierender Zellen (APC) modulieren. 3) Neben mDCs stellen auch Makrophagen eine weitere wichtige Art von APCs dar. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass auch Makrophagen durch rFlaA:Betv1-Stimulation aktiviert werden können. Innerhalb der Makrophagen wird durch rFlaA:Betv1 eine Myeloid differentiation primary-response protein 88 (MyD88)-, Jun N-terminale Kinase (JNK)-MAPK- und teilweise TLR5-abhängige Zytokinsekretion induziert. Zudem konnte die Induktion des Warburg-Effekts in Makrophagen beobachtet werden, die aus dem Knochenmark differenziert wurden (bone marrow derived macrophages, BMDMs). Darüber hinaus wurde mit Hilfe von RNA-Sequenzierung und Western Blot Analysen die Hochregulierung des Janus kinase (JAK)-Signaltransduktionsweges und des signal transductor and activator of transcription (STAT)-Transkriptionsfaktors hypoxia-inducible factor 1 α (HIF-1α) identifiziert. Diese Ergebnisse konnten mithilfe „Seahorse“ Extracellular Flux Assays bestätigt werden. Es zeigte sich, dass rFlaA:Betv1 eine ausgeprägte Verschiebung des Metabolismus in Richtung der Glykolyse in BMDMs verursachte. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die Stimulation mit rFlaA:Betv1 in einer Kokultur bestehend aus BMDMs mit Bet v 1-spezifischen, Th2-basierten, CD4+ T-Zellen die Ausschüttung von Th2-Zytokinen unterdrückt, während gleichzeitig die Ausschüttung von Th1- und entzündungshemmenden Zytokinen erhöht wurde. Die Ergebnisse, welche in Verlauf dieser Arbeit publiziert werden konnten, lassen darauf schließen, dass es sich bei Man2 um ein potentielles Adjuvans handelt, während rFlaA:Betv1 als potentiell neuartiges Therapeutikum für die Behandlung von Typ I Allergien eingesetzt werden könnte. Durch die Ergebnisse dieser Studien konnte ein wichtiger Beitrag für die künftige Entwicklung sicherer und effektiver Impfstoffe und Therapeutika geleistet werden.

German
Book Title: Immunological characterization of Man2 as a novel adjuvant and rFlaA:Betv1 as a therapeutic candidate for allergy treatment
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VII, 155 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering
Date Deposited: 22 Sep 2022 13:12
Last Modified: 23 Sep 2022 09:21
DOI: 10.26083/tuprints-00022284
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-222845
Referees: Schülke, PD. Dr. Stefan ; Warzecha, Prof. Dr. Heribert
Date of oral examination: 1 September 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/22284
PPN: 49960301X
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