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Evaluation of ADC Physicochemical Characteristics and Their Impact on Pharmacokinetics in Transgenic huFcRn Mice

Kaempffe, Anna (2022):
Evaluation of ADC Physicochemical Characteristics and Their Impact on Pharmacokinetics in Transgenic huFcRn Mice. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00021848,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Evaluation of ADC Physicochemical Characteristics and Their Impact on Pharmacokinetics in Transgenic huFcRn Mice
Language: English
Abstract:

Antibody-drug conjugates (ADCs) are a promising and fast-growing class of targeted anti-cancer therapeutics. They consist of highly potent chemotherapeutic drugs that are covalently linked to monoclonal antibodies (mAbs) which guide the drug to cancer cells. The concept of targeted delivery of a chemotherapeutic agent via an ADC aims at enhanced therapeutic efficacy and safety compared to the individual components of an ADC - the mAb and cytotoxic agent. Despite various successful ADC approvals, their development is complex and associated with a high risk of costly late-stage failures. It has been shown that the overall design of an ADC and every component can influence the critical physicochemical properties which in turn can lead to fast non-specific clearance of the ADCs. Elevated non-specific clearance can directly affect the efficacy and safety and limit the therapeutic window of ADCs. To address this problem, the aim of this study was to evaluate physicochemical property assays that indicate a risk for poor pharmacokinetics (PK) of ADCs. Physicochemical property assays were applied to an ADC series to evaluate whether ADC hydrophobicity (hydrophobic interaction chromatography (HIC)), thermal stability (nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF)), and the binding behavior to the human neonatal Fc-receptor (huFcRn; huFcRn binding kinetics by Bio-Layer Interferometry (BLI)) could serve as an indicator of the PK of the ADCs that was analyzed in huFcRn transgenic Tg276 mice. For this, eight trastuzumab-based ADCs with a homogenous DAR of 2 (drug-to-antibody ratio of 2) were generated by conjugation to cysteines, genetically introduced at positions N325, L328, S239, D265, or S442, and by enzymatic conjugation via microbial transglutaminase (mTG) either to C-terminal light (LC) or heavy chain (HC) recognition motifs or to the endogenous position Q295 of the native antibody. Interestingly, pronounced differences in the ADC PK profiles were observed which allowed to confirm the recently described position L328 as favorable site for cysteine conjugation, comparable to the well-established position S239, and emphasizes the favorable position Q295 of native antibodies and the tagged LC antibody variant for enzymatic conjugations via mTG. Furthermore, to explore if conjugation site and method effects would apply to antibody scaffolds other than trastuzumab, two of the positions, L328 and the mTG LC variant, were evaluated in context of the clinically evaluated mAbs briakinumab and secukinumab. This showed that the influence of conjugation sites and methods on PK resulted in same ADC PK rankings also for briakinumab- and secukinumab-based variants. Physicochemical property assay data were obtained for all study ADCs and correlated with ADC clearance (CL) that serves as important PK parameter. Interestingly, similar huFcRn binding and differently pronounced hydrophobicity and thermal stabilities were observed which did not correlate with the ADC CL values. Consequently, additional physicochemical property assays were explored in this study that could serve as indicators for poor PK of ADCs and that were adapted from various reports where they allowed prediction of poor PK of mAbs. To enable a more robust correlation between PK and the in vitro assay outcome, 13 ADCs were used that varied not only in the conjugation site and method but also in the DAR and antibody scaffold and for which a broad range of CL values (1.18-8.38 mL/h/kg) were observed in hemizygous huFcRn Tg276 mice. These ADCs were assessed by seven physicochemical property assays that were implemented to analyze either the degree of self-association (clone self-interaction Bio-Layer Interferometry (CSI-BLI) and affinity-capture self-interaction nanoparticle spectroscopy (AC-SINS)), non-specific binding (polyspecificity reagent Bio-Layer Interferometry (PSR-BLI), baculovirus particle (BVP) and heparin enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)), hydrophobicity (bis-ANS), or huFcRn binding (huFcRn affinity chromatography). Assay data was used for the correlation to CL values. Overall, ADCs with lower CL showed lower assay results compared to ADCs with fast CL (about >4 mL/h/kg) which showed elevated assay results. These results indicate for the first time that the selected in vitro assays could be a powerful tool for the early development not only for mAbs but also for ADCs allowing the selection of ADCs with favorable PK characteristics. Consequently, application of the in vitro assay panel could serve as screening paradigm for PK risk mitigation during early ADC development. However, further work is needed to expand the data set and to conduct robust statistical analyses which could serve as basis to define thresholds for each assay.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) sind eine vielversprechende und schnell wachsende Klasse innerhalb der zielgerichteten Krebstherapeutika. Sie bestehen aus hochwirksamen Chemotherapeutika, die kovalent an monoklonale Antikörper (mAbs) gebunden sind, welche das Chemotherapeutikum zu den Krebszellen transportieren. Das Konzept der gezielten Zustellung eines Chemotherapeutikums über ein ADC ermöglicht eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit und Sicherheit im Vergleich zu den einzelnen Komponenten eines ADC - dem mAb und dem zytotoxischen Wirkstoff. Obwohl bereits verschiedene ADCs erfolgreichen zugelassen wurden, ist deren Entwicklung komplex und mit einem hohen Risiko kostspieliger Fehlschläge in späten Entwicklungsstadien verbunden. Es hat sich gezeigt, dass das Gesamtdesign eines ADCs und ebenso jede einzelne Komponente die kritischen physikochemischen Eigenschaften des ADCs beeinflussen können, was wiederum zu einer schnellen unspezifischen Clearance der ADCs führen kann. Eine erhöhte unspezifische Clearance kann sich direkt auf die Wirksamkeit und Sicherheit auswirken und das therapeutische Fenster des ADCs verkleinern. Um dieses Problem zu adressieren, war das Ziel dieser Studie Methoden zu bewerten mit denen sich physikochemische Eigenschaften von ADCs analysieren lassen und die genutzt werden könnten, um auf ein Risiko für eine schlechte Pharmakokinetik (PK) der ADCs hinzuweisen. Diese Methoden wurde auf eine Serie von ADCs angewandt, um zu bewerten, ob die Hydrophobizität (Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)) und thermische Stabilität (nano differential scanning fluorimetry (nanoDSF)) der ADCs sowie das Bindungsverhalten an den human neonatalen Fc-Rezeptor (huFcRn; huFcRn Bindungskinetik mittels Bio-Layer-Interferometrie (BLI)) Hinweise auf die PK der ADCs geben können, die in huFcRn-transgenen Tg276-Mäusen analysiert wurden. Zu diesem Zweck wurden acht Trastuzumab-basierte ADCs mit einer homogenen DAR von 2 (Wirkstoff-Antikörper-Verhältnis von 2) hergestellt. Die Konjugation erfolgte entweder an Cysteine, die genetisch an den Positionen N325, L328, S239, D265 oder S442 eingefügt wurden, oder enzymatisch mittels mikrobieller Transglutaminase (mTG) entweder an C-terminale Erkennungsmotive der leichten (LC) oder schweren Kette (HC) oder an die endogene Position Q295 des nativen Antikörpers. Interessanterweise wurden deutliche Unterschiede in den PK-Profilen der ADCs beobachtet, die es ermöglichten die kürzlich beschriebene Position L328 als geeignete Stelle für die Cystein-Konjugation zu bestätigen, vergleichbar mit der gut etablierten Position S239. Darüber hinaus ermöglichte dies die Eignung der Position Q295 des nativen Antikörpers und der mit Erkennungsmotiv generierter LC-Antikörpervariante für enzymatische Konjugationen via mTG hervorzuheben. Um zu untersuchen, ob die Auswirkungen der Konjugationsstelle und -methode auch für andere Antikörpergerüste als Trastuzumab gelten, wurden zwei der Positionen, L328 und die mTG-LC-Variante, zusätzlich im Zusammenhang mit den klinisch evaluierten mAbs Briakinumab und Secukinumab bewertet. Dabei zeigte sich, dass auch bei den Briakinumab- und Secukinumab-basierten Varianten der Einfluss der Konjugationsstellen und Methoden auf die PK zu einer gleichen Rangfolge in der PK führte. Für alle ADCs wurden Daten zu ihren physikochemischen Eigenschaften mit den oben genannten Methoden erhoben und mit der ADC Clearance korreliert, da die Clearance (CL) ein wichtiger PK-Parameter ist. Interessanterweise wurde jedoch eine ähnliche huFcRn-Bindung und unterschiedlich ausgeprägte Hydrophobizität und thermische Stabilitäten beobachtet, die nicht mit den CL-Werten der ADCs korrelierten. Folglich wurden in dieser Studie zusätzliche Methoden auf ihre Eignung als Indikator für ein schlechtes PK-Verhalten von ADCs untersucht, die aus verschiedenen Berichten adaptiert wurden, in denen sie eine Vorhersage der schlechten PK von mAbs ermöglichten. Um eine robustere Korrelation zwischen der PK und den Ergebnissen der In-vitro Methoden zu ermöglichen, wurden 13 ADCs verwendet, die sich nicht nur in der Konjugationsposition und Konjugationsmethode, sondern auch in ihrer DAR und dem Antikörpergerüst unterschieden und für die in hemizygoten huFcRn-Tg276-Mäusen ein breites Spektrum an CL-Werten (1,18-8,38 ml/h/kg) beobachtet wurde. Die unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften dieser ADCs wurden mittels sieben verschiedener Methoden bewertet. Diese wurden implementiert, um entweder den Grad der Selbstassoziation (Klon-Selbstinteraktions Bio-Layer-Interferometrie (CSI-BLI) und Affinity Capture Selbstinteraktions-Nanopartikel-Spektroskopie (AC-SINCS)), der unspezifischen Bindung (Polyspezifitätsreagenz Bio-Layer-Interferometrie (PSR-BLI), Baculoviren-Partikel (BVP) und Heparin-Enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA)), der Hydrophobizität (bis-ANS) oder der huFcRn-Bindung (huFcRn-Affinitäts-Chromatographie) der ADCs zu analysieren. Die Daten aus den Analysen wurden für die Korrelation mit den CL-Werten verwendet. Insgesamt zeigten ADCs mit niedriger CL auch niedrigere Ergebnisse in den Tests, während im Vergleich dazu ADCs mit schneller CL (in etwa >4 ml/h/kg) höhere Test-Ergebnisse aufwiesen. Diese Ergebnisse deuten zum ersten Mal darauf hin, dass die ausgewählten In-vitro-Methoden ein leistungsfähiges Instrument für die frühe Entwicklung nicht nur von mAbs, sondern auch von ADCs sein könnten, da sie ermöglichen ADCs mit günstigen PK-Eigenschaften auszuwählen. Folglich könnte die Anwendung dieser In-vitro-Methoden als Screening-Paradigma für die PK-Risikominimierung während der frühen ADC-Entwicklung dienen. Allerdings sind noch weitere Arbeiten erforderlich, um den Datensatz zu erweitern und robuste statistische Analysen durchzuführen, die als Grundlage für die Festlegung von Grenzwerten für jeden Assay dienen könnten.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: IV, 132 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 05 Aug 2022 12:04
Last Modified: 16 Dec 2022 16:40
DOI: 10.26083/tuprints-00021848
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-218487
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Neumann, Prof. Dr. Siegfried
Date of oral examination: 21 July 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/21848
PPN: 49906268X
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