TU Darmstadt / ULB / TUprints

Impact of iron on CHO metabolism and recombinant protein production

Weiß, Christine Hilde (2022):
Impact of iron on CHO metabolism and recombinant protein production. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00021046,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Impact of iron on CHO metabolism and recombinant protein production
Language: English
Abstract:

Iron is an essential transition metal required in cell culture medium (CCM) due to its vital role in many cellular processes such as energy metabolism, deoxyribonucleic acid (DNA) biosynthesis or antioxidant functions. However, due to its redox capabilities, iron can also catalyze Fenton reactions favoring the formation of reactive oxygen species (ROS) that may cause severe cellular damages. This study sought to investigate the impact of iron in CCM on Chinese hamster ovary (CHO) cell line performance, on critical quality attributes (CQAs) of different recombinant proteins, on messenger ribonucleic acid (mRNA) expression levels of genes involved in iron homeostasis, and on intracellular iron or labile iron pool (LIP) levels, whereby for the last two readouts a method development was performed prior to analyzing the project relevant samples. Besides the successful establishment of a ferrozine-based assay for detecting total intracellular iron amount and the promising results obtained upon testing the fluorescent probe RhoNox-1 for detecting changes in LIP concentrations, none of the other two (fluorescent) probes tested during method development, namely calcein and TRX-PURO, were able to determine LIP amounts within CHO cells. Since those probes rely on a rather high LIP concentration present within cells, a low LIP present within CHO cells either due to a limited, saturated or low iron uptake, or due to an immediate distribution or usage of iron within the cells once taken up was thus suggested. Data also revealed that iron raw material impurities are strongly impacting cell performance and CQAs. Whereas manganese was identified as the main impurity improving cell performance and altering protein glycosylation level within Cellvento® 4CHO and 4Feed fed-batch platform with manganese presenting additionally an opposite effect on cell culture compared to iron, copper impurity contributed to an overall increased cell performance of the tested CHOZN® cell line in EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch-Medium platform. Usage of low impurity iron raw materials is therefore crucial to decouple the effects of iron and its trace element impurities by controlling and adjusting each element concentration independently and thereby guarantee the run of consistent and stable cell culture processes. Among the different iron sources tested within CCM during a fed-batch experiment, non-chelated iron sources caused a faster decrease in measured iron concentration within the supernatant and led to a higher detected iron amount present within the cell pellets taken during the course of the fed-batch process compared to the tested chelated iron sources, whereas no cell growth was obtained upon ferric chloride (FeCl3) usage. At a first glance, data suggest an increased uptake efficiency for CHO cells upon usage of non-chelated iron sources, however, differences might have rather come from a faster iron precipitate formation within CCM upon usage of non-chelated iron sources, additionally, since mRNA expression levels of genes involved in iron uptake did not indicate for a difference between chelated and non-chelated iron sources. The removal of possible iron precipitates prior to intracellular iron measurement as well as the investigation of the fate of iron in CCM seems thus to be crucial to understand iron-related uptake mechanisms.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Eisen ist ein essentielles Übergangsmetall und wichtiger Bestandteil von Zellkulturmedien, da es in vielen zellulären Prozessen, unter anderem im Energiestoffwechsel, der Biosynthese von Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder bei antioxidativen Mechanismen, eine wichtige Rolle spielt. Aufgrund seiner Redoxaktivität kann Eisen jedoch auch Fenton-Reaktionen katalysieren, die die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) begünstigen, welche mitunter zu schweren Zellschäden führen können. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss von Eisen im Zellkulturmedium auf das Wachstum und die Produktion von Ovarienzellen eines chinesischen Hamsters (CHO) und auf kritische Qualitätsmerkmale verschiedener rekombinanter Proteine untersucht. Zudem wurde die Wirkung von Eisen auf das Expressionslevel von Boten-Ribonukleinsäure (mRNA) von Genen, die an der Eisenhomöostase beteiligt sind, und auf den intrazellulären Eisengehalt beziehungsweise den labilen Eisenpool (LIP) analysiert, wobei für die beiden letzteren Untersuchungen eine Methodenentwicklung vorausging. Neben der erfolgreichen Etablierung eines Ferrozin-basierten Assays zum Nachweis der gesamten intrazellulären Eisenmenge und den Ergebnissen, die bei der Testung der Fluoreszenzsonde RhoNox-1 zum Nachweis von veränderten LIP Konzentrationen erzielt wurden, konnte keine der beiden anderen während der Methodenentwicklung getesteten (Fluoreszenz-)Sonden (Calcein oder TRX-PURO) LIP Konzentrationen in CHO Zellen nachweisen. Da die Verwendung dieser Sonden eine relativ hohe LIP Konzentration in Zellen voraussetzt, wurde eine geringe LIP-Konzentration in CHO Zellen vermutet. Dies könnte entweder auf eine begrenzte, gesättigte oder geringe zelluläre Eisenaufnahme, oder auf eine sofortige Verteilung beziehungsweise Verwendung des aufgenommenen Eisens innerhalb der Zellen zurückzuführen sein. Die Daten zeigten zudem, dass sich Verunreinigungen im Eisenrohstoff stark auf das Wachstum, die Produktion und auf die kritischen Qualitätsmerkmale des rekombinanten Proteins auswirken. Erhöhte Manganverunreinigungen trugen zu einem verbesserten Zellwachstum, einer gesteigerten Proteinproduktion und einem veränderten Proteinglykosylierungsprofil in der Cellvento® 4CHO und 4Feed Fed-Batch Medienplattform bei, wobei Mangan zusätzlich einen gegensätzlichen Effekt im Vergleich zu Eisen auf die Zellkultur aufwies. Kupferverunreinigung wurden dahingegen als Hauptursache für eine gesteigerte Zellleistung der getesteten CHOZN®-Zelllinie in der EX-CELL® Advanced CHO Fed-Batch Medienplattform identifiziert. Die Verwendung von Eisenrohstoffen mit geringen Verunreinigungen ist daher von entscheidender Bedeutung, um die Auswirkungen von Eisen und seinen Spurenelementverunreinigungen in der Zellkultur zu entkoppeln. Durch die unabhängige Zugabe der einzelnen Elemente zum Zellkulturmedium können die Konzentrationen besser voneinander kontrolliert und angepasst werden, um so letztendlich konsistente und stabile Zellkulturprozesse zu gewährleisten. Von den verschiedenen Eisenquellen, die im Zellkulturmedium während eines Fed-Batch Experiments getestet wurden, verursachten nicht-chelatierte Eisenquellen im Vergleich zu chelatierten Eisenquellen eine schnellere Abnahme der gemessenen Eisenkonzentration im Zellkulturüberstand und führten zu einer höheren nachgewiesenen Eisenmenge in den Zellpellets, die während des Fed-Batch Prozesses der Zellkultur entnommen wurden. Die Verwendung von Eisenchlorid (FeCl3) führte dagegen zu gar keinem Zellwachstum. Auf den ersten Blick deuten die Daten auf eine erhöhte Eisenaufnahmeeffizienz der CHO Zellen bei Verwendung von nicht-chelatierten Eisenquellen hin. Jedoch könnten die Unterschiede auch auf eine schnellere Bildung von Eisenpräzipitaten innerhalb des Zellkulturmediums bei Verwendung von nicht-chelatierten Eisenquellen zurückzuführen sein, da auch die untersuchten mRNA-Expressionslevel von Genen, die in die Eisenaufnahme involviert sind, auf keinen Unterschied zwischen chelatierten und nicht-chelatierten Eisenquellen hinwiesen. Die Entfernung möglicher Eisenpräzipitate vor der Bestimmung von intrazellulärem Eisen sowie die Charakterisierung der vorliegenden Eisenformen nach der Eisenzugabe zum Zellkulturmedium scheinen daher essentiell, um ein umfangreicheres und tiefgründigeres Verständnis und Wissen für eisenbezogene Aufnahmemechanismen zu entwickeln.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: vi, 134 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 31 Mar 2022 12:22
Last Modified: 04 Aug 2022 09:25
DOI: 10.26083/tuprints-00021046
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-210460
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Preuß, Prof. Dr. Karlheinz D.
Date of oral examination: 16 February 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/21046
PPN: 494267828
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