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Variability and viral safety of cell culture media to ensure process performance in the biopharmaceutical industry

Djemal, Leila (2022):
Variability and viral safety of cell culture media to ensure process performance in the biopharmaceutical industry. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020993,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Variability and viral safety of cell culture media to ensure process performance in the biopharmaceutical industry
Language: English

This PhD project focuses on two topics related to the optimization of the cell culture media for monoclonal antibody (mAb) production in the biopharmaceutical industry. The first topic aims at developing a better understanding of the batch-to-batch variability of soy protein hydrolysates used in cell culture media to ensure robustness of the mAb production process. The second topic is about mitigation of viral contamination risk of cell culture media using high-temperature short to ensure safety of mAb production processes. A challenging aspect with the use of protein hydrolysates in the manufacturing processes of recombinant therapeutic proteins is their impacts on the protein production due to a lack of understanding of batch-to-batch variability. Soy hydrolysates variability and its impact on fed-batch production of a recombinant monoclonal antibody (mAb) expressed in Sp2/0 cells were studied using 37 batches from the same supplier. The batch-to-batch variability of soy hydrolysates impacted cell growth, mAb titer and mAb quality. Physico-chemical characterization of batches confirmed that soy hydrolysates are mainly a source of amino acids and peptides containing lower amounts of other components such as carbohydrates and chemical elements in cell culture media. Soy hydrolysates composition of different batches was consistent except for trace elements. Statistical analyses identified iron as a potential marker of a poor process performance. To verify this correlation, two forms of iron, ferric ammonium citrate and ferrous sulfate, were added to a batch of soy hydrolysates associated to a low level of iron during cell culture. Both forms of iron significantly reduced cell growth, mAb titer and increased level of the acidic charge variants of the mAb. Excess of iron in the process might lead to significant negative impacts on process performance and product quality. This lethal process, named ferroptosis in the literature, is described by the iron Fe(II)-dependent accumulation of lipid reactive oxygen species and the peroxidation of polyunsaturated fatty acids leading to their depletion and the accumulation of toxic lipid reactive oxygen species (ROS). To counterbalance the negative effect of excess of iron, an iron chelating agent and a specific inhibitor of ferroptosis were used in our assays. Increasing levels of the iron chelating agent in the cell culture media led to a significant increase of the mAb titers for batches of soy hydrolysates containing high level of iron. Ferrostatin-1 supplementation, a known inhibitor of ferroptosis, did not offer cell protection from the excess of iron during cell culture in our assay. Two main potential causes of increased iron were investigated in close collaboration with the vendor of soy protein hydrolysates: the soy starting material and the manufacturing process steps. Trace elements in soy starting material and all along the manufacturing process were measured to identify the source of the higher level of iron in the soy hydrolysates. The iron content in soy starting material remained steady, while during the manufacturing process iron content tended to increase. The manufacturing step causing iron increase in soy hydrolysates was identified. Consequently, we highlighted how the manufacturing process may impact the final trace elements composition of soy hydrolysates and finally mAb production. Those observations allowed to define an additional critical quality attributes of soy hydrolysates to reach a better management of soy hydrolysates batch-to-batch variability for the monoclonal antibody production. It is important to notice that variable levels of trace elements can occur for other raw materials used in cell culture media, including chemically defined cell culture raw materials. Therefore, it becomes important to control trace elements levels in raw materials used in cell culture media to ensure process performance. In addition, fingerprinting analysis of soy hydrolysates combined with chemometric did not allow to build a model that predicts the performance of a given batch of soy hydrolysates using our dataset. Only LC-MS analysis brought to light some potential markers of a good performance. In addition to batch-to-batch variability concern associated to cell culture medium raw materials, cell culture medium raw materials are also known as the major source of viral contamination in the biotechnology industry. The prevention strategy of viral contamination events can be reinforced by eliminating or inactivating adventitious viruses in cell culture media during the manufacturing process. Filters of 0.1 μm porosity are commonly used to protect bioreactors from bacteria and mycoplasma contaminations but do not offer protection from viral contaminations. High-temperature short-time (HTST) treatment of cell culture media is known to be an efficient barrier to inactivate viruses. One major challenge of HTST application is the compatibility with medium composition. Media may contain heat-labile components that can precipitate or get degraded during heating. Here, the compatibility of HTST treatment with media and feed solutions of two fed-batch processes for monoclonal antibody (mAb) production were assessed. Media were heated at least at 95°C for 5 or 10 seconds using the FT74-20-MkIII-UHT/HTST system. HTST treatment did not affect the measured physico-chemical properties of the media and the feed solutions except for one complex medium for which heating induces an increase of the medium turbidity. A precipitate was also collected on the surface of the HTST heat exchanger plates identified as a mix of hydroxyapatite and iron oxides. A fluidized sand batch was used to collect, analyse, and troubleshoot the precipitate formation associated with high temperature treatment of this cell culture medium. Calcium phosphate precipitation was identified as the cause of the increased turbidity of the complex medium. The presence of iron chelators in the medium in contact with stainless steel was pointed out to be the cause of iron oxides formation. Nevertheless, for both fed-batch processes, the use of HTST system neither impacted the cell culture performance negatively, nor the product quality. Therefore, HTST treatment is compatible with media except for those containing high ratio of calcium and phosphate or, in this example, iron chelating agents.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Dieses Promotionsvorhaben konzentriert sich auf zwei Themen im Zusammenhang mit der Optimierung von Zellkulturmedien. Das erste Thema zielt darauf ab, ein besseres Verständnis für die Chargenvariabilität von Sojaproteinhydrolysaten zu entwickeln, die in Zellkulturmedien verwendet werden, um die Robustheit des Produktionsprozesses von monoklonalen Antikörpern (mAb) zu gewährleisten. Das zweite Thema befasst sich mit der Minderung des Risikos einer viralen Kontamination von Zellkulturmedien durch Kurzzeiterhitzung, um die Sicherheit der mAb-Produktionsprozesse zu gewährleisten. Ein problematischer Aspekt bei der Verwendung von Proteinhydrolysaten in Herstellungsverfahren für rekombinante therapeutische Proteine ist ihr Einfluß auf die Proteinproduktion, da die Variabilität von Charge zu Charge nicht bekannt ist. Die Variabilität von Sojahydrolysaten und ihre Auswirkungen auf die Fed-Batch-Produktion eines rekombinanten monoklonalen Antikörpers, der in Sp2/0-Zellen exprimiert wird, wurden anhand von 37 Chargen desselben Herstellers untersucht. Die Variabilität der Sojahydrolysate von Charge zu Charge hatte Auswirkungen auf das Zellwachstum, den Titer und die Produktqualität. Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Chargen bestätigte, dass Sojahydrolysate hauptsächlich eine Quelle für Aminosäuren und Peptide sind, wobei geringere Mengen an anderen Komponenten wie Kohlenhydrate und chemische Elemente in Zellkulturmedien enthalten sind. Die Zusammensetzung der Sojahydrolysate der verschiedenen Chargen war mit Ausnahme der Spurenelemente einheitlich. Statistische Analysen ergaben, dass Eisen ein potenzieller Marker für eine schlechte Prozessleistung ist. Um diesen Zusammenhang zu überprüfen, wurden einer Charge von Sojahydrolysaten, die mit einem niedrigen Eisengehalt während der Zellkultur in Verbindung gebracht wurde, zwei Formen von Eisen, Eisen(III)-ammoniumcitrat und Eisen(II)-sulfat, zugesetzt. Beide Eisenformen verringerten signifikant das Zellwachstum, den mAb-Titer und erhöhten den Gehalt der sauren Ladungsvarianten des mAb. Der Eisengehalt von Sojahydrolysaten kann zu erheblichen negativen Auswirkungen auf die Prozessleistung und Produktqualität führen. Dieser letale Prozess, der in der Literatur als Ferroptose bezeichnet wird, beruht auf der Fe(II)-abhängigen Akkumulation reaktiver Sauerstoffspezies in den Lipiden und die Peroxidation mehrfach ungesättigter Fettsäuren, die zu deren Verarmung und zur Akkumulation toxischer reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den Lipiden führt. Um die negativen Auswirkungen des Eisenüberschusses auszugleichen, wurde in unseren Versuchen ein Eisenchelatbildner und ein spezifischer Ferroptose-Inhibitor verwendet. Die Erhöhung des Eisenchelatbildners in den Zellkulturmedien führte zu einer signifikanten Steigerung der finalen volumetrischen Produktivität bei Sojahydrolysaten mit hohem Eisengehalt. Die Zugabe von Ferrostatin-1, einem bekannten Inhibitor der Ferroptose, bot den Zellen in unserem Versuch keinen Schutz vor dem Eisenüberschuss während der Zellkultur. In enger Zusammenarbeit mit dem Anbieter von Sojaproteinhydrolysaten wurden zwei mögliche Hauptursachen für den erhöhten Eisengehalt untersucht: das Soja-Ausgangsmaterial und die Herstellungsschritte. Es wurden Spurenelemente im Soja-Ausgangsmaterial und während des gesamten Herstellungsprozesses gemessen, um die Quelle des erhöhten Eisengehalts in den Sojahydrolysaten zu ermitteln. Der Eisengehalt im Sojaausgangsmaterial blieb konstant, während der Eisengehalt während des Herstellungsprozesses tendenziell anstieg. Der Herstellungsschritt, der für den Anstieg des Eisengehalts in Sojahydrolysaten verantwortlich ist, wurde identifiziert. Folglich konnten wir aufzeigen, wie sich der Herstellungsprozess auf die endgültige Spurenelement¬zusammen¬setzung von Sojahydrolysaten und schließlich auf die mAb-Produktion auswirken kann. Diese Beobachtungen ermöglichten es, zusätzliche kritische Qualitätsmerkmale von Sojahydrolysaten zu definieren, um ein besseres Management der Variabilität von Sojahydrolysaten von Charge zu Charge für die Produktion monoklonaler Antikörper zu erreichen. Es ist wichtig zu beachten, dass eine solche Kontamination durch Spurenelemente während des Herstellungsprozesses nicht nur bei Sojahydrolysaten, sondern bei allen Rohstoffen, die im Zellkulturmedium verwendet werden, einschließlich chemisch definierter Zellkulturrohstoffe, auftreten kann. Die vorliegende Arbeit hat gezeigt, dass es daher wichtig ist, die Kontamination von Rohstoffen, die in Zellkulturmedien verwendet werden, mit Spurenelementen zu kontrollieren, um die Prozessleistung sicherzustellen. Darüber hinaus war es mit der Fingerprinting-Analyse von Sojahydrolysaten in Kombination mit der Chemometrie nicht möglich, ein Modell zu erstellen, das die Performance einer bestimmten Charge von Sojahydrolysaten anhand unseres Datensatzes vorhersagt. Durch LC-MS-Analyse konnten einige potenzielle Marker für eine gute Prozessleistung identifiziert werden. Neben der Schwankung der Chargenvariabilität, die mit Zellkulturmedium-Rohstoffen verbunden ist, sind Zellkulturmedium-Rohstoffe auch als Hauptquelle für virale Kontaminationen in der Biotechnologieindustrie bekannt. Filtration von Zellkulturmedien oder deren Hitzeinaktivierung sind bekannte Maßnahmen zur Vorbeugung viraler bzw. mikrobieller Kontaminationen. Die üblicherweise verwendeten Filter mit einer Porosität von 0,1 μm schützen Bioreaktoren vor Bakterien- und Mykoplasmenkontaminationen, bieten aber keinen ausreichenden Schutz vor viralen Kontaminationen. Die Kurzzeiterhitzung (HTST) von Zellkulturmedien ist bekanntlich eine wirksame Barriere, um diese zu verhindern. Ein Hauptproblem bei der HTST-Anwendung ist die Kompatibilität mit der Zusammensetzung des Mediums. Medien können hitzelabile Komponenten enthalten, die beim Erhitzen ausfallen oder geschädigt werden können. In dieser Arbeit wurde die Kompatibilität der HTST-Behandlung mit Medien und Feed-Lösungen von zwei Fed-Batch-Prozessen für die Produktion monoklonaler Antikörper untersucht. Die Medien wurden mit dem FT74-20-MkIII-UHT/HTST-System mindestens 5 oder 10 Sekunden lang auf 95 °C erhitzt. Die HTST-Behandlung wirkte sich nicht auf die gemessenen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Medien und der Feed-Lösungen aus, mit Ausnahme eines komplexen Mediums, bei dem die Erhitzung zu einer Erhöhung der Trübung des Mediums führte. Außerdem wurde brobachtet, dass sich auf der Oberfläche der HTST-Wärmetauscherplatten ein Niederschlag sammelte, der als eine Mischung aus Hydroxylapatit und Eisenoxiden identifiziert wurde. Zur Sammlung, Analyse und Fehlersuche bei der Bildung von Präzipitaten aufgrund der hohen Temperatur dieses Zellkulturmediums wurde ein Wirbelsandansatz verwendet. Die Präzipitatbildung von Kalziumphosphat wurde mit der Zunahme der Trübung des komplexen Mediums in Verbindung gebracht. Das Vorhandensein von Eisenchelatoren im Medium, das mit Edelstahl in Berührung kommt, wurde für die Bildung von Eisenoxiden verantwortlich gemacht. Bei beiden Fed-Batch-Prozessen wirkte sich der Einsatz des HTST-Systems jedoch weder auf die Zellkulturleistung noch auf die Produktqualität negativ aus. Daher ist die HTST-Behandlung mit Medien kompatibel, außer mit solchen, die einen hohen Anteil an Kalzium und Phosphat oder, wie in diesem Beispiel, Eisenchelatbildner enthalten.

Place of Publication: Darmstadt
Collation: 156 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 04 Apr 2022 12:18
Last Modified: 04 Apr 2022 12:18
DOI: 10.26083/tuprints-00020993
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-209931
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Hagen, Prof. Dr. Jörg von
Date of oral examination: 14 February 2022
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20993
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