TU Darmstadt / ULB / TUprints

Towards the engineering of a magneto sensitive potassium channel

Brocca, Lorenzo (2022):
Towards the engineering of a magneto sensitive potassium channel. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020264,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Towards the engineering of a magneto sensitive potassium channel
Language: English
Abstract:

Optogenetics is the most widely used technique employed by neuroscientists to control neuronal activity with high spatial and temporal resolution either in vitro and in vivo. Optogenetics relies on naturally occurring or synthetic ion channels whose gating is controlled by light. Both excitatory and inhibitory optogenetic tools are currently available to remotely promote or prevent neuronal firing. Inhibitory tools are of particular interest as therapeutic agent for the treatment of neuropathic pain, a pathology caused by nerve lesion/inflammation that generates uncontrolled firing in peripheral sensory neurons. Given the limited penetration of light into tissues that greatly hampers the usage of optogenetic tools in vivo, the search is on for novel, alternative ways to stimulate inhibitory tools. Magneto-genetics was recently proposed as an alternative technique to optogenetics. It relies on the capability of external magnetic fields, which deeply penetrate into tissues, to activate ion channels. Initially, the heat-activated channel TRPV1 was conjugated to exogenously supplied iron oxide nanoparticles. The latter generate heat in response to an oscillating magnetic field and this rise in temperature is responsible for the opening of TRPV1. In the second generation of magneto-genetic tools the TRPV channels (TRPV1-4) have been linked to ferritin, a 24-mer protein forming an hollow sphere that can store up to 4500 iron atoms. Activation of ferritin-engineered TRPV channels by oscillating magnetic fields was reported to occur both in vitro and in vivo experiments. The physical principle behind the working mechanism of magneto-genetic tools is unclear and presently debated. However, in the case of Magneto2.0, a TRPV4-based channel, it was shown experimentally that opening is due to the rise in temperature, generated by ferritin upon exposure to an oscillating magnetic field. To date, all magneto-genetic tools use TRPV channels, which mainly conduct calcium, magnesium and sodium ions, limiting the spectrum of application of these tools to neuronal excitation. The aim of this work is to generate a potassium (K⁺) magneto-genetic tool, with the long term aim to use it in the treatment of neuropathic pain. In nature, all known temperature-sensitive potassium channels are polymodal, i.e., they respond to a number of stimuli, beside temperature. This finding motivated us to engineer a member of the viral potassium channel family, Kcv Next to Smith (KcvNTS), into a temperature sensitive channel. To this end, we fused at its C terminus the cytosolic domain of the temperature sensitive bacterial sodium channel NavAe1. One of the engineered constructs, called v1, showed the wanted property of being closed at 37°C and open >45°C. We introduced single point mutations in the C-terminal of v1 to fine-tune the temperature range of gating. Mutation M267A decreased the opening temperature of the channel from 45°C to 40°C, making this a good tool for mammals. The M267A mutant was renamed “Temperature Induced Channel for K⁺” (TICK1). TICK1 activation and deactivation kinetics were characterized, showing an activation τ of around 10 seconds and a variable deactivation τ, ranging from 66 to 672 seconds. In parallel, we also characterized the ferritin that we intended to connect to TICK. According to Stanley et al, 2015, the moiety is formed by a dimer, obtained by the fusion of light and heavy chain monomers. This ensures a light/heavy chain ratio of 1:1, which was reported to increase the iron uptake. We further added a EGFP at the N terminus of the dimer and demonstrated that this construct, construct EGFP-mFT, assembles into 12mer ferritins in HEK293 cells. We then tested by correlation spectroscopy if magnetic fields affect the engineered ferritins, but no changes in diffusion coefficients were found in the presence of static magnetic fields. Purified ferritins were further analyzed by Inductively coupled plasma - optical emission spectrometry (ICP-OES) to measure their iron content, revealing that each ferritin in average contains 583 atoms of iron, a result in accordance with the physiological iron content of mammalian ferritins. As a next step we built our magneto-genetic tool: TICK1 was modified with an N-terminal EGFP nanobody (nanoTICK1) and this construct was co-expressed in HEK293T cells with EGFP-mFT. The nanobody ensures the binding of ferritin to the channel that was renamed MagKCV. After preliminary testing proper MagKCV membrane localization and temperature activation, we investigated the magnetic properties of this synthetic channel. An experimental setup was built with a cylindrical permanent magnet manually moved back and forth from the cell at 1Hz generating a maximum magnetic field of around 50mT. Experiments were conducted with cells maintained at 37°C. Around 20% of tested cells expressing MagKCV showed an activation of the channel in response to magnetic field. The activation of MagKCV is slower than the one of TICK1, but still maintains the typical TICK1 current-voltage relationship and barium sensitivity. In the control condition, with no magnetic field exposure, 1cell over 40 tested (2,5%) showed an open channel, indicating that MagKCV might be slightly less regulated than TICK1 (100% of temperature regulation, n=37). MagKCV appears to be a promising prototype for the development of the first K⁺ magneto-genetic tool.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Optogenetik ist die am weitesten verbreitetese Technik, die von Neurowissenschaftlern zur Steuerung der neuronalen Aktivität mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vitro und in vivo eingesetzt wird. Optogenetik stützt sich auf natürlich vorkommende oder synthetische Ionenkanäle, deren Gating durch Licht gesteuert wird. Derzeit sind sowohl exzitatorische als auch inhibitorische optogenetische Werkzeuge verfügbar, um elektrische Aktivität in Neuronen aus der Ferne zu fördern oder zu verhindern. Inhibitorische Werkzeuge sind von besonderem Interesse als therapeutische Mittel für die Behandlung von neuropathischen Schmerzen, einer Pathologie, die durch Nervenläsionen/Entzündungen verursacht wird und unkontrolliertes Feuern in peripheren sensorischen Neuronen erzeugt. Angesichts der begrenzten Eindringtiefe von Licht in Gewebe, die den Einsatz optogenetischer Werkzeuge in vivo stark behindert, wird nach neuen, alternativen Wegen zur Stimulierung hemmender Werkzeuge gesucht. Vor kurzem wurde die Magneto-Genetik als alternative Technik zur Optogenetik vorgeschlagen. Sie beruht auf der Fähigkeit externer Magnetfelder, die tief in das Gewebe eindringen, Ionenkanäle zu aktivieren. Dazu wurde zunächst der hitzeaktivierte Kanal TRPV1 mit exogen zugeführten Eisenoxid-Nanopartikeln konjugiert. Letztere erzeugen als Reaktion auf ein oszillierendes Magnetfeld Wärme und dieser Temperaturanstieg ist für die Öffnung von TRPV1 verantwortlich. In der zweiten Generation von magneto-genetischen Werkzeugen wurden die TRPV-Kanäle (TRPV1-4) mit Ferritin verknüpft, einem 24-meren Protein, das eine Hohlkugel bildet, die bis zu 4500 Eisenatome speichern kann. Die Aktivierung von TRPV-Kanälen mit Ferritin durch oszillierende Magnetfelder wurde sowohl in vitro als auch in vivo Experimenten nachgewiesen. Das physikalische Prinzip, das hinter dem Wirkmechanismus der magneto-genetischen Werkzeuge steht, ist unklar und wird derzeit diskutiert. Im Fall von Magneto2.0, einem TRPV4-basierten Kanal, konnte jedoch experimentell gezeigt werden, dass die Öffnung auf den Temperaturanstieg zurückzuführen ist, der durch Ferritin bei Einwirkung eines oszillierenden Magnetfelds erzeugt wird. Bislang verwenden alle magneto-genetischen Werkzeuge TRPV-Kanäle, die hauptsächlich Kalzium-, Magnesium- und Natriumionen leiten, was das Anwendungsspektrum dieser Werkzeuge auf neuronale Erregung beschränkt. Ziel dieser Arbeit ist es, ein magnetogenetisches Werkzeug für Kalium (K⁺) zu entwickeln, das langfristig zur Behandlung von neuropathischen Schmerzen eingesetzt werden soll. In der Natur sind alle bekannten temperatursensitiven Kaliumkanäle polymodal, d. h. sie reagieren auf eine Reihe von Reizen neben der Temperatur. Diese Erkenntnis hat uns dazu motiviert, ein Mitglied der viralen Kaliumkanalfamilie, Kcv Next to Smith (KcvNTS), in einen temperaturempfindlichen Kanal zu verwandeln. Zu diesem Zweck haben wir die zytosolische Domäne des temperaturempfindlichen bakteriellen Natriumkanals NavAe1 an seinen C-Terminus fusioniert. Eines der Konstrukte, v1 genannt, zeigte die gewünschte Eigenschaft, bei 37°C geschlossen und >45°C geöffnet zu sein. Wir führten einzelne Punktmutationen in den C-Terminus von v1 ein, um den Temperaturbereich für das Gating den Kanals fein abzustimmen. Die Mutation M267A verringerte dabei die kritische Öffnungstemperatur des Kanals von 45°C auf 40°C, was ihn zu einem guten Werkzeug für Säugetiere macht. Die M267A-Mutante wurde in "Temperaturinduzierter Kanal für K⁺" (TICK1) umbenannt. Die Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik von TICK1 wurde charakterisiert. Sie zeigt eine exponentill zunehmende Aktivierung mit einer Zeitkonstante τ von etwa 10 Sekunden; die Deaktivierung ist varaibale mit τ Weren zwischen 66 und 672 Sekunden. Parallel dazu haben wir auch das Ferritin charakterisiert, das wir mit TICK verbinden wollten. Nach Literaturangaben wird eine Ferritin Einheit durch ein Dimer gebildet, das durch die Fusion von Monomeren der leichten und schweren Kette entsteht. Dies gewährleistet ein Verhältnis von leichter zu schwerer Kette von 1:1, was Berichten zufolge die Eisenaufnahme erhöht. Wir fügten außerdem ein grün fluoreszierendes Protein (EGFP) am N-Terminus des Dimers hinzu und wiesen nach, dass dieses Konstrukt, EGFP-mFT, in HEK293-Zellen zu 12mer-Ferritinen assembliert. Anschließend testeten wir mittels Korrelationsspektroskopie, ob Magnetfelder die konstruierten Ferritine beeinflussen. In diesen Experimenten wurden jedoch keine Veränderungen der Diffusionskoeffizienten in Gegenwart statischer Magnetfelder festgestellt. Gereinigte Ferritine wurden weiter mit induktiv gekoppeltem Plasma - optischer Emissionsspektrometrie (ICP-OES) analysiert, um ihren Eisengehalt zu messen. Dabei zeigte sich, dass jedes Ferritin im Durchschnitt 583 Eisenatome enthält, ein Ergebnis, das mit dem physiologischen Eisengehalt von Säugetierferritinen übereinstimmt. In einem nächsten Schritt bauten wir unser magneto-genetisches Werkzeug: TICK1 wurde dazu mit einem N-terminalen EGFP-Nanobody (nanoTICK1) modifiziert und dieses Konstrukt wurde in HEK293T-Zellen zusammen mit EGFP-mFT exprimiert. Der Nanobody gewährleistet die Bindung von Ferritin an den Kanal, der in MagKCV umbenannt wurde. Nach ersten Tests zur korrekten Membranlokalisierung und Temperaturaktivierung von MagKCV haben wir die magnetischen Eigenschaften dieses synthetischen Kanals untersucht. Dazu wurde ein Versuchsaufbau mit einem zylindrischen Dauermagneten aufgebaut, der manuell mit 1 Hz von der Zelle hin und her bewegt wurde und ein maximales Magnetfeld von etwa 50 mT erzeugte. Die Experimente wurden mit Zellen durchgeführt, die bei 37°C gehalten wurden. Etwa 20% der getesteten Zellen, die MagKCV exprimieren, zeigten eine Aktivierung des Kanals als Reaktion auf das Magnetfeld. Die Aktivierung von MagKCV ist langsamer als die von TICK1, behält aber immer noch die typische TICK1-Strom-Spannungs-Eigenschaften und die Bariumempfindlichkeit bei. In der Kontrollbedingung, ohne Magnetfeld-Exposition, zeigten nur 1 von 40 getesteten Zellen (2,5%) einen offenen Kanal, was darauf hindeutet, dass MagKCV etwas weniger reguliert sein könnte als TICK1 (100%ige Temperaturregulation, n=37). MagKCV scheint ein vielversprechender Prototyp für die Entwicklung des ersten magneto-genetischen K⁺-Tools zu sein.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 82 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
Date Deposited: 04 Jan 2022 14:21
Last Modified: 04 Jan 2022 14:22
DOI: 10.26083/tuprints-00020264
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-202643
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard ; Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 10 November 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20264
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