TU Darmstadt / ULB / TUprints

Investigating the dynamic rewiring of the p53 network

Mittermeier, Anna (2021):
Investigating the dynamic rewiring of the p53 network. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00020206,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Investigating the dynamic rewiring of the p53 network
Language: English
Abstract:

A cell has to react to a multitude of different extrinsic and intrinsic stress signals on a daily basis. This challenging task is fulfilled by intracellular signaling pathways with pleiotropic functions. The dynamics of these signaling pathways contribute to information processing and determine cellular outcomes, therefore they are tightly regulated by complex molecular networks. In this study, the transcription factor p53 and its activity in response to DNA damage is used as a paradigm to investigate the underlying regulatory principles. The dynamic p53 response relies on a balance between repeated activation through DNA damage and the transcriptional induction of negative feedback regulators. Strikingly, a pulsatile p53 response results in activation of genes involved in cell cycle arrest and DNA repair, while sustained high p53 levels trigger transcriptional programs associated with apoptosis. This was demonstrated by pharmacological and genetic perturbation of direct p53 network members. However, p53 dynamics are determined by different layers of regulation including interaction with physiological signaling that can directly shape the dynamics of the p53 response and its posttranslational modifications, which are responsible for p53 target gene activation. Importantly, although individual interaction points with other signaling networks have been reported, a comprehensive understanding of how these pathways modulate p53 is lacking. For this reason, the present thesis aims to systematically identify further p53 modulators apart from direct network members and to evaluate their contribution in determining p53-associated cell fates. To this end, live-cell time-lapse microscopy was deployed in order to monitor the p53 response to ionizing radiation in single cells upon varying perturbations in cancer as well as non-transformed reporter cell lines. As part of a collaboration project, I revealed that upon perturbation of the cell survival pathway NF-κB, the p53 response is delayed and displays changes in distinct features. Complementing my single cell data with mathematical modeling, it was elucidated that three different processes are affected by NF-κB inhibition: The activation as well as degradation of p53 and degradation of Mdm2. Furthermore, in a small-scale screening approach, I identified positive modulators of the p53 response: The immune pathways STAT3 and STAT6. While the increase in p53 upon STAT3 activation can be linked to Mdm2, the effect of STAT6 is Mdm2-independent. Instead, the initial activation of p53 is necessary to observe the increase in the p53 response. Last, I established a large-scale screening approach to decipher how the activity of p53 in response to ionizing radiation is controlled by different epigenetic modifiers. Surprisingly, I found that inhibition of a series of deacetylases and acetyltransferases both lead to a reduction in p53 transcription. Despite that, the p53 target gene p21 is upregulated and p53-independent mechanism could be confirmed. My findings demonstrate the complexity of how p53 is modulated by numerous processes in the cell and suggest mechanisms how cellular pathways can interact in more detail. However, I found that the p53 network is surprisingly stable against single perturbations, especially concerning p53-driven cell fates. Hence, the present thesis sets the basis for large-scale screening experiments to systematically assess dynamic changes in signaling molecules, thereby providing large data sets with high resolution and reproducibility.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Eine Zelle muss täglich auf eine Vielzahl extrinsischer und intrinsischer Stresssignale reagieren. Diese herausfordernde Aufgabe wird von intrazellularen Signalwegen mit pleiotropen Funktionen bewältigt. Die Dynamiken dieser Signalwege tragen zur Verarbeitung von Informationen bei und bestimmen das Resultat auf zellulärer Ebene, weshalb sie durch komplexe molekulare Netzwerke streng reguliert werden. In dieser Studie wird der Transkriptionsfaktor p53 und seine Aktivität als Reaktion auf DNA-Schädigung als Modell herangezogen, um die zugrundeliegenden Prinzipien seiner Regulation zu untersuchen. Die dynamische p53-Antwort beruht auf einem Gleichgewicht zwischen wiederholter Aktivierung durch DNA-Schäden und der Transkriptionsinduktion von negativen Feedback-Regulatoren. Bemerkenswerterweise folgt auf eine pulsatile p53-Antwort die Aktivierung von Genen, die am Zellzyklusarrest und der DNA-Reparatur beteiligt sind, während anhaltend hohe p53-Level Transkriptionsprogramme auslösen, die mit Apoptose assoziiert werden. Dies konnte durch pharmakologische und genetische Perturbationen von direkten Mitgliedern des p53-Netzwerkes gezeigt werden. Allerdings werden p53-Dynamiken durch verschiedene Instanzen reguliert, welche die Interaktion mit physiologischen Signalwegen, die die Dynamiken der p53-Antwort direkt formen, und posttranslationale Modifikationen, die für die Aktivierung von p53-Zielgenen verantwortlich sind, beinhalten. Wichtig ist hierbei, dass, obwohl individuelle Interaktionspunkte mit anderen Signalwegen bekannt sind, ein umfassendes Verstehen, wie diese p53 modulieren, fehlt. Aus diesem Grund zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, auf systematische Weise weitere p53-Modulatoren neben den direkten Mitgliedern des Netzwerkes zu identifizieren und ihren Beitrag am p53-assoziierten Zellschicksal zu beurteilen. Zu diesem Zweck wurde Lebendzell-Zeitraffer-Mikroskopie eingesetzt, um die p53-Antwort auf ionisierende Strahlung in Einzelzellen unter variierenden Perturbationen in Krebs- als auch in nicht-transformierten Reporterzelllinien zu verfolgen. Als Teil eines Kollaborationsprojekts konnte ich aufdecken, dass die p53-Antwort unter Perturbation des mit Zellüberleben assoziierten NF-κB-Signalwegs zeitlich verzögert auftritt und Veränderungen in spezifischen Merkmalen aufweist. Meine Einzelzell-Daten wurden mit mathematischer Modellierung ergänzt und es konnten drei verschiedene Prozesse ausgemacht werden, die von der NF-κB-Inhibition betroffen sind: Die Aktivierung sowie Degradation von p53 und die Degradation von Mdm2. Des Weiteren habe ich in einem klein angelegten Screening-Ansatz positive Modulatoren der p53-Antwort identifiziert: Die Immunsignalwege STAT3 und STAT6. Während die beobachtete p53-Erhöhung bei STAT3-Aktivierung mit Mdm2 in Verbindung gebracht werden kann, ist der Effekt von STAT6 Mdm2-unabhängig. Stattdessen ist die vorangehende Aktivierung von p53 nötig, um die Erhöhung der p53-Antwort zu beobachten. Schließlich habe ich einen groß angelegten Screening-Ansatz etabliert, um aufzudecken, wie die Aktivität von p53 nach ionisierender Strahlung von verschiedenen epigenetischen Modifikatoren kontrolliert wird. Überraschenderweise habe ich herausgefunden, dass die Inhibition einer Reihe von Deacetylasen und Acetyltransferasen zu einer Reduktion der p53-Transkription führen. Im Gegensatz dazu war das p53-Zielgen p21 hochreguliert und es konnten p53-unabhängige Mechanismen bestätigt werden. Meine Ergebnisse demonstrieren die Komplexität, mit der p53 durch zahlreiche Prozesse in der Zelle reguliert wird, und weisen auf Mechanismen hin, wie zelluläre Signalwege im Detail interagieren können. Allerdings habe ich auch herausgefunden, dass das p53-Netzwerk auf erstaunliche Art stabil gegenüber einzelnen Perturbationen ist, besonders, was das p53-gesteuerte Zellschicksal angeht. Aus diesem Grund setzt die vorliegende Arbeit den Grundstein für Experimente im großen Maßstab, um systematisch dynamische Veränderungen in Signalmolekülen festzustellen und dabei große Datensätze mit hoher Auflösung und Reproduzierbarkeit zu liefern.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: VII, 155 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Systems Biology of the Stress Response
Date Deposited: 21 Dec 2021 07:58
Last Modified: 21 Dec 2021 07:58
DOI: 10.26083/tuprints-00020206
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-202067
Referees: Loewer, Prof. Dr. Alexander ; Löbrich, Prof. Dr. Markus
Refereed: 10 November 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20206
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