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Effects of O-GlcNAcylation on radiation-induced DNA double-strand break repair

Averbek, Sera (2021):
Effects of O-GlcNAcylation on radiation-induced DNA double-strand break repair. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität Darmstadt,
DOI: 10.26083/tuprints-00020192,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Effects of O-GlcNAcylation on radiation-induced DNA double-strand break repair
Language: English
Abstract:

DNA integrity is continuously threatened by various hazards such as cytotoxic chemicals, radiation or metabolic reactions, which potentially inflict DNA damage including DNA double-strand breaks (DSBs), the most harmful type of DNA damage. To maintain genome integrity, damaged DNA must be repaired accurately to prevent genomic instability that leads to diseases including cancer. Post translational modifications (PTMs) such as phosphorylation, ubiquitination or acetylation are essential to orchestrate DNA damage-response and repair mechanisms. Recent studies revealed an involvement of O-linked-N-acetylglucosaminylation (O-GlcNAcylation) in DNA damage response, which is an abundant, dynamic and reversible PTM of cellular proteins and very sensitive to environmental nutrient supply. O-GlcNAcylation occurs at amino acid Ser or Thr residues, which are also a target of phosphorylation. Therefore, O-GlcNAcylation and phosphorylation are suggested to compete. The aim of the study was to investigate different aspects of the regulatory role of O-GlcNAcylation on DNA-damage response in dependence of damage complexity and cell-cycle phase. O-GlcNAc transferase (OGT) and O-GlcNAcase (OGA) inhibitors were used in order to change cellular O-GlcNAcylation level. DNA damage of different complexity was induced with low (X-rays) or high LET (linear energy transfer) radiation (C-, Fe- and He-ion) in selected human cell lines. Different approaches were used including γH2AX-foci assay, live-cell microscopy, Fluorescence Lifetime Microscopy (FLIM), westernblot analysis and protein-immunoprecipitation to detect DSB rejoining, accumulation of NBS1 at DNA damage site, chromatin states and O-GlcNAcylation of repair relevant factors upon irradiation respectively. First, induction of O-GlcNAcylation at the DSB site was examined with fluorescence co-localization analysis of 53BP1 and O-GlcNAc. They showed a radiation induced increase of O-GlcNAcylation within the nuclear compartment after X-ray or heavy-ion irradiation; specific O-GlcNAcylation at DSB sites however, was observed after heavy-ion irradiation only. The influence of O-GlcNAcylation on DSB repair was examined after X-ray and charged particles irradiation. It revealed that O-GlcNAcylation promotes DSB repair independent of DNA-damage complexity. Promotion of DSB repair occurs by stimulating homologous recombination (HR) and potentially an additional repair mechanism, which was revealed by studying repair of radiation induced DSBs in dependence of an siRNA-mediated knockdown of HR factor RAD51 together with modulating O-GlcNAcylation. Live-cell experiments suggested that inhibition of OGT disturbs the accumulation of NBS1 to X-ray induced DSBs. Moreover, MDC1 was confirmed to be O-GlcNAcylated, and HR factors CtIP and BRCA1 were shown to be modulated by O-GlcNAcylation upon irradiation. OGT and OGA activity also regulate chromatin compaction states that are proposed to be an important determinant of DSB repair pathway choice. Collectively, the data demonstrated multiple roles of O-GlcNAcylation in the repair of radiation induced DSBs concluding that O-GlcNAcylation is an important PTM to maintain genomic stability.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die Integrität der DNA wird durch verschiedene Einflüsse, wie zytotoxische Chemikalien, Strahlung oder Stoffwechselreaktionen, ständig gefährdet. Zu den induzierten DNA-Schäden gehören auch äußerst schädliche DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs). Die beschädigte DNA muss korrekt repariert werden, um einen Stabilitätsverlust des Genoms zu verhindern, welcher zu Krankheiten wie Krebs führen kann. Posttranslationale Modifikationen (PTMs) wie Phosphorylierung, Ubiquitinierung oder Acetylierung sind essentiell für das Zusammenspiel verschiedener DNA-Schadensreaktionen und -Reparaturmechanismen. Jüngste Studien zeigten, dass O-GlcNAcylierung an der DNA-Schadensantwort beteiligt ist. Viele zelluläre Proteine tragen diese reversible und dynamische PTM, die sensitiv auf die Nährstoffzufuhr reagiert. Die O-GlcNAcylierung von Proteinen erfolgt an den Aminosäureresten der Aminosäuren Serin oder Threonin. Da diese Aminosäuren häufig auch Ziel einer Phosphorylierung sind, geht man davon aus, dass O-GlcNAcylierung und Phosphorylierung konkurrieren. Ziel der Studie war es, verschiedene Aspekte der regulatorischen Rolle der O-GlcNAcylierung auf die DNA-Schadensantwort in Abhängigkeit von Schadenskomplexität und Zellzyklusphase zu untersuchen. Um das zelluläre O-GlcNAcylierungsniveau zu ändern, wurden O-GlcNAc-Transferase (OGT)- und O-GlcNAcase (OGA)-Inhibitoren verwendet. DNA-Schäden unterschiedlicher Komplexität wurden in verschiedenen humanen Zelllinien durch Bestrahlung mit Niedrig- (Röntgen) oder Hoch-LET-Strahlung (C-, Fe- und He-Ionen) induziert. Mit verschiedenen Techniken, wie dem γH2AX-Foci-Assay, Lebendzellmikroskopie, Fluorescence-Lifetime-Mikroskopie (FLIM), Westernblot-Analyse und Protein-Immunopräzipitation, wurde nach Bestrahlung die Verknüpfung von DSBs, die Rekrutierung von NBS1 an DNA-Schäden, der Chromatinstatus sowie die O-GlcNAcylierung Reparatur-relevanter Proteine untersucht. Zunächst wurde die Induktion von O-GlcNAcylierung an strahlungsinduzierten DSBs mit Hilfe einer Fluoreszenz-Kolokalisationsanalyse von 53BP1 und O-GlcNAc untersucht. Diese zeigte eine strahlungsinduzierte Zunahme der O-GlcNAcylierung innerhalb des Kernkompartiments nach Röntgen- oder Schwerionenbestrahlung; eine spezifische O-GlcNAcylierung an DSB-Stellen wurde jedoch nur nach Schwerionenbestrahlung beobachtet. Der Einfluss der O-GlcNAcylierung auf die DSB-Reparatur wurde nach Röntgenbestrahlung und Bestrahlung mit geladenen Teilchen untersucht. Es zeigte sich, dass die O-GlcNAcylierung die DSB-Reparatur unabhängig von der DNA-Schadenskomplexität begünstigt. Die Steigerung der DSB-Reparatur erfolgt durch Stimulation der homologen Rekombination (HR) und möglicherweise eines zusätzlichen Reparaturmechanismus; auf diesen wiesen Untersuchungsergebnisse der Reparatur von strahlungsinduzierten DSBs in Abhängigkeit eines siRNA-vermittelten Knockdowns des HR-Faktors RAD51 und gleichzeitiger Modulation der O-GlcNAcylierung hin. Experimente mit lebenden Zellen legten nahe, dass Hemmung von OGT die Rekrutierung von NBS1 an röntgeninduzierten DSBs stört. Im Rahmen dieser Arbeit wurde bestätigt, dass MDC1 durch O-GlcNAcylierung modifiziert wird, und gezeigt, dass die HR-Faktoren CtIP und BRCA1 strahlungsabhängig durch O-GlcNAcylierung moduliert werden. OGT und OGA regulieren auch die Kompaktheit des Chromatins, von der man ausgeht, dass sie ein wichtiger Faktor für die Wahl des DSB-Reparaturwegs ist. Zusammenfassend zeigten die Daten mehrere Rollen der O-GlcNAcylierung bei der Reparatur von strahlungsinduzierten DSBs auf, woraus zu schließen ist, dass diese PTM relevant ist, um die genomische Stabilität aufrechtzuerhalten.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: ix, 70 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Radiation Biology and DNA Repair
TU-Projects: DFG|GRK1657|GRK 1657
Date Deposited: 20 Dec 2021 08:26
Last Modified: 20 Dec 2021 08:26
DOI: 10.26083/tuprints-00020192
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-201923
Referees: Löbrich, Prof. Dr. Markus ; Löwer, Prof. Dr. Alexander
Date of oral examination: 22 November 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/20192
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