TU Darmstadt / ULB / TUprints

Oligospecific Human Antibodies with Therapeutic Potential Derived from Immunized Chickens

Bogen, Jan Patrick (2021)
Oligospecific Human Antibodies with Therapeutic Potential Derived from Immunized Chickens.
Technische Universität Darmstadt
doi: 10.26083/tuprints-00019360
Ph.D. Thesis, Primary publication, Publisher's Version

Dissertation Jan Patrick Bogen.pdf
Copyright Information: CC BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution ShareAlike.

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Oligospecific Human Antibodies with Therapeutic Potential Derived from Immunized Chickens
Language: English
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald ; Hock, PD Dr. Björn ; Klein, PD Dr. Christian
Date: 2021
Place of Publication: Darmstadt
Collation: xvi, 239 Seiten
Date of oral examination: 23 July 2021
DOI: 10.26083/tuprints-00019360

In the last decades, monoclonal antibodies (mAbs) emerged as a powerful biologic entity for diagnostic and therapeutic applications and is today the most successful class of biologics. Even though rodent immunization combined with subsequent humanization is conventionally used to produce monoclonal antibodies for therapeutic use, this technology comes with some limitations. Human-derived antigens utilized for immunization are often sequence homologous to their murine counterpart and therefore less immunogenic, restricting the number of potential addressed epitopes. Therefore, in recent years avian-immunization has emerged as a potential new approach for the generation of monoclonal antibodies. Due to the phylogenetic distance of chickens to humans, additional epitopes can be addressed that could not be targeted utilizing rodents, enabling additional mode of actions for therapeutic applications.

Next generation antibodies, like antibody-drug-conjugates (ADCs) or bispecific antibodies (bsAb), were excessively investigated in recent years. However, the generation of bsAb in an IgG-like design remains challenging due to the need of four polypeptide chains to assemble in the correct way to facilitate bispecific binding. To circumvent the light chain pairing problem, the easiest way is to utilize common light chains (cLC). Such light chains complement both heavy chains and allow an IgG-like architecture while facilitating bispecific binding.

The first investigation in the frame of the present cumulative study was focused on the establishment of yeast surface display (YSD)-based panning in a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-assisted high throughput manner. Furthermore, to verify whether this technology is suitable for the discovery of bispecific and biparatopic antibodies, a common light chain approach was conducted. Panning of a cLC-based chicken-derived anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) immune library was performed against Calcein-AM stained EGFR+++ A431 cells. By utilizing a viability staining approach, only living cells were investigated without the need do genetically modify the target cell, as mandatory for prior published studies. Via FACS, cell-cell complexes, consisting of immuno-stained yeast cells expressing a Fab fragment bound to Calcein-AM-stained mammalian cells, were sorted over multiple selection rounds. Antibodies exhibiting diverse sequences were isolated that specifically bound A431 cells but not EGFR- Jurkat cells. Reformatted antibodies reveled favorable stability, aggregation and specificity while exhibiting notable affinity. Furthermore, a broad epitope space was covered, including the therapeutically interesting epitope of Cetuximab, an Food and Drug Administration (FDA)-approved anti-EGFR mAb. This was the first report of yeast panning utilizing an immune library, and furthermore the first study investigating cLC-based antibodies derived from chickens. These results paved the way for panning against other membrane proteins that could not be produced as a soluble antigen, such as G-protein coupled receptors (GPCRs). Additionally, it expanded the methodology used for the generation of cLC-based biparatopic and bispecific antibodies.

The second investigation elucidated the generation of biparatopic anti-EGFR chicken antibodies, derived from a common light chain YSD library. At first, an EGF-blocking antibody targeting domain III on EGFR was isolated from a chicken-derived cLC-library. This antibody was then utilized as a detection antibody to screen the same library again for EGFR-binding. As the newly isolated antibody must target an orthogonal epitope to the first antibody, a second mAb targeting the domain II was isolated. By utilizing the knob-into-hole (KiH) technology, a bispecific antibody was generated. Besides improved affinity, it was able to cluster the soluble extracellular domains (ECD) of EGFR as shown by size-exclusion chromatography (SEC) experiments. Furthermore, cell-bound EGFR was clustered as shown by improved antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). This mode of action was mediated by the mix-site binding profile of the biparatopic antibody. Mixed-site binding referred to the ability of a biparatopic antibody to bind two different EGFR molecules at the same time or the inability to bind both epitopes on one EGFR molecule simultaneously. This allows for the additional binding of two biparatopic antibodies to one antigen, resulting in clustering of the antigen. Effective clustering of the target was demonstrated using Biolayer interferometry (BLI)- and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)-based experiments. The methodology to generate biparatopic antibodies by an epitope binning-based screening might accelerate the discovery of therapeutic mAbs exhibiting biparatopic binding behaviors in the future. Furthermore, this study represents the first bispecific chicken-derived antibody as well as the first cLC-based biparatopic molecule.

The third investigation evaluated the usage of a new next generation sequencing (NGS)-assisted method for the humanization of chicken-derived single-chain fragment variable (scFvs) using YSD and FACS. To this end, the complementary determining regions (CDRs) of two chicken-derived anti-EGFR scFvs were grafted onto the most homologous human germline sequences encoding for VH and VL, respectively. Additionally, six Vernier residues in the VH and four in the VL sequences were partially randomized to encode either the human or the chicken germline residue at this position. Since the Vernier residues are crucial for the orientation of the CDRs and therefore for antigen binding, the most human antibody with the highest affinity can be identified. Humanization was performed in a library-based approach, both in the scFv and the Fab format. Next generation sequencing after two FACS sorting rounds revealed enrichment of certain Vernier combinations. The humanized antibodies were produced as scFv-Fc fusions or full-length IgG antibodies, respectively. Biophysical analysis showed improved stability and aggregation behavior while nearly maintaining the wild-type affinity. Additionally, germline identity was comparable to those of therapeutically approved humanized antibodies. This technology therefore enables the fast and convenient humanization of chicken-derived antibodies through a generic process, further expanding the usage of avian immunization for therapeutic applications.

In the fourth study, the previously generated EGF-blocking mAb was affinity maturated by a novel type of light chain shuffling approach based on the disruption of the binding by mutating the heavy chain CDRs and the selection of a novel VL domain, able to restore binding. This new light chain was chosen as a cLC for the screening of an anti-CD16a and an anti-PD-L1 library. The resulting CD16a binder bound with high affinity to both human CD16a isotypes and blocked the interaction to human IgG1 Fc. The PD-L1 binder exhibited an overlapping epitope with Durvalumab, an FDA-approved anti-PD-L1 antibody, and effectively blocked the interaction of PD-1 and PD-L1. The three Fab fragments were subsequently humanized and subcloned into a trispecific 2+1 antibody, with one heavy chain comprising the anti-EGFR-Fab arm and one heavy chain encoding the anti-PD-L1 Fab as a head-to-tail fusion to the anti-CD16a Fab. The trispecific molecule was able to bind all three antigens with high affinity and in a simultaneous manner. By co-targeting EGFR and PD-L1, the trispecific antibody facilitated an enhanced CD16a-mediated ADCC effect compared to the EGFR×CD16a bispecific. The utilization of a common light chain eases the production and engineering of 2+1 bi- and trispecifics and might contribute to the generation of avian-derived oligospecific therapeutic antibodies in the future.

The last part of this work elucidated the possibilities to engineer pH-dependent binding behavior into a common light chain of a bispecific CEACAM5×CEACAM6 antibody. To this end, two histidines were incorporated into the CDR-L1 or the CDR-L3 or both, respectively, of the VL germline IGKV3-15. A YSD library was screened for antibodies binding to CEACAM5 at pH 7.4 and non-binding at pH 6.0. Two light chain variants with pH-dependent binding properties were isolated. By permutation of respective histidines in a rational manner, three new variants were generated, exhibiting elevated pH-dependence as shown by BLI-experiments. The light chain mediating the strongest pH-responsive binding was furthermore paired with the CEACAM6-binding heavy chain. Subsequent BLI experiments revealed no pH-dependence, indicating that pH-responsive binding is only mediated in combination with the VH domain the light chain was originally screened with. A bispecific antibody was generated, which bound CEACAM5 pH-dependently and CEACAM6 pH-independently. Furthermore, upon pH-dependent dissociation, the antibody was able to rebind to CEACAM5 for multiple cycles. This methodology could be used to engineer additional modes of action into already existing common light chain bi- or multispecifics antibodies as well as to swiftly generate pH-responsive mAbs from scratch.

In summary, these investigations illuminated a straightforward methodology to generate humanized multispecific chicken-derived antibodies. Different engineering strategies were elucidated to optimize affinities and incorporate pH-dependent specificity, paving the way for tailor-made therapeutics.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

In den letzten Jahrzehnten haben monoklonale Antikörper (mAbs) ihren Wert als leistungsfähige biologische Moleküle für diagnostische und therapeutische Anwendungen unter Beweis gestellt und sind heute die erfolgreichste Klasse von Biologika. Obwohl die Immunisierung von Nagetieren in Kombination mit einer anschließenden Humanisierung standardmäßig zur Generierung von monoklonalen Antikörpern für den therapeutischen Einsatz angewandt wird, ist diese Technologie mit einigen Einschränkungen verbunden. Die humanen Antigene, welche für die Immunisierung verwendet werden, sind oft sequenzhomolog zum murinen Ortholog und daher weniger immunogen, was die Anzahl der potenziell adressierten Epitope einschränken kann. Daher wurde in den letzten Jahren die Immunisierung von Vögeln als potenzieller neuer Ansatz für die Generierung von monoklonalen Antikörpern erforscht. Aufgrund des evolutionären Distanz vom Huhn zum Menschen können zusätzliche Epitope adressiert werden, die bei der Verwendung von Nagetieren nicht targetiert werden könnten, was zusätzliche Wirkmechanismen für therapeutische Anwendungen ermöglicht.

Sogenannte „next generation“ Antikörper, wie Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs) oder bispezifische Antikörper (bsAb), waren in den letzten Jahren Gegenstand intensiver Forschungsarbeit. Die Herstellung von bsAb mit einer IgG-ähnlichen Architektur stellt jedoch nach wie vor eine Herausforderung dar, da vier Polypeptidketten in der richtigen Weise zusammengefügt werden müssen, um einen funktionellen bsAb zu erhalten. Um das Problem der Leichtkettenpaarung zu umgehen, ist der einfachste Weg die Verwendung einer sogenannten „common light chain“ (cLC). Solche leichten Ketten können mit beiden schweren Ketten gleichermaßen assemblieren und ermöglichen eine IgG-ähnliche Architektur, ohne Einschränkung des Bindungsverhaltens.

Die erste Untersuchung im Rahmen der vorliegenden kumulativen Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung einer Panningmethode, basierend auf Hefe-Oberflächen-Display (YSD) und Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) im Hochdurchsatz. Um zu validieren, ob die entwickelte Technologie für die Generierung bispezifischer und biparatopischer Antikörper geeignet ist, wurde ein cLC Ansatz gewählt. Das Panning einer cLC-basierten, Hühner-Immunbibliothek gegen den Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) wurde gegen Calcein-AM gefärbte EGFR+++ A431 Zellen durchgeführt. Durch die Verwendung dieses Viabilitätsfarbstoffes wurden nur lebende Zellen im FACS analysiert, ohne dass diese Zelllinie genetisch modifiziert werden musste, wie es bei früheren Studien üblich war. Mittels FACS wurden Zell-Zell-Komplexe, bestehend aus immungefärbten Hefezellen, die ein Fab-Fragment exprimieren, gebunden an viabilitätsgefärbte Säugetierzellen, über mehrere Selektionsrunden angereichert. Es wurden Antikörper mit unterschiedlichen Sequenzen isoliert, die spezifisch A431-Zellen, nicht aber EGFR-negative Jurkat-Zellen banden. Die löslich produzieren Antikörper wiesen eine hervorragende Stabilität, Aggregation und Spezifität auf und besaßen eine bemerkenswerte Affinität. Darüber hinaus wurde mehrere unterschiedliche Epitope adressiert, darunter auch das therapeutisch interessante Epitop von Cetuximab, einem therapeutisch zugelassenen anti-EGFR Antikörper. Dies stellte die erste über ein Hefe-Panning angereicherte Immunbibliothek dar und demonstrierte darüber hinaus zum ersten Mal, dass Hühner-Antikörper mit dem cLC-Konzept kompatibel sind. Diese Ergebnisse ebneten den Weg für das Panning gegen andere Membranproteine, die nicht als lösliches Antigen produziert werden könnten, wie beispielsweise G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs). Zusätzlich wurden die Methodiken zur Generierung von cLC-basierten biparatopischen und bispezifischen Antikörpern erweitert.

Die zweite Studie befasste sich mit der Generierung von biparatopischen Anti-EGFR-Antikörpern, isoliert aus einer cLC Hühner-Immunbibliothek. Zunächst wurde ein EGF-blockierender Antikörper, der die Domäne III des EGFR targetierte, identifiziert. Dieser Antikörper wurde dann als Detektionsantikörper verwendet, um die gleiche Bibliothek erneut auf EGFR-Bindung zu sortieren. Da der neu isolierte Antikörper ein orthogonales Epitop zum ersten Antikörper erkennen muss, konnte ein zweiter mAb isoliert werden, welcher die Domäne II adressierte. Durch die Verwendung der „Knob-into-Hole“ (KiH)-Technologie wurde ein bispezifischer Antikörper generiert. Neben einer verbesserten Affinität vermittelte dieser biparatopische Antikörper das Clustern von löslichem EGFR, was durch Größenausschlusschromatographie-Experimente (SEC) nachgewiesen wurde. Darüber hinaus wurde auch zellgebundenes EGFR geclustert, was sich in einer verbesserten Antikörper-abhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC) zeigte. Diese Wirkungsweise wurde durch das „Mixed-Site“-Bindungsprofil des biparatopischen Antikörpers vermittelt. Die Mixed-Site-Bindung beschreibt in diesem Zusammenhang die Fähigkeit eines biparatopischen Antikörpers, zwei verschiedene EGFR-Moleküle gleichzeitig zu binden oder die Unfähigkeit, beide Epitope auf einem einzelnen EGFR-Molekül zeitgleich binden zu können. Dies ermöglicht die zusätzliche Bindung von zwei biparatopischen mAb an ein Antigenmolekül, was zu einem Clustern des Antigens führt. Effektives Clustering von EGFR wurde in Bio-Layer-Interferometrie (BLI)- und Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)-basierten Experimenten nachgewiesen. Die Methode zur Generierung biparatopischer Antikörper durch ein Epitop-Binning-basiertes Screening könnte in Zukunft die Entdeckung therapeutischer mAbs mit biparatopischem Bindungsverhalten beschleunigen. Darüber hinaus stellt diese Studie den ersten bispezifischen Antikörper aus Hühnern sowie den ersten cLC-basierten biparatopischen Antikörper dar.

Die dritte Studie evaluierte die Verwendung einer neuen „Next Generation Sequencing“ (NGS)-basierten Methode für die Humanisierung von Hühner-abgeleiteten Einzelketten-Antikörper (scFvs) unter Verwendung von YSD und FACS. Dazu wurden die complementary determining regions (CDRs) von zwei anti-EGFR Hühner-scFvs auf sequenzähnliche menschlichen Framework-Regionen transplantiert, welche für VH bzw. VL kodierten. Zusätzlich wurden sechs Vernier-Reste in den VH- und vier in den VL-Sequenzen teilweise randomisiert, um entweder die menschlichen oder die Hühner-Keimbahn-Aminosäuren an diesen Positionen zu kodieren. Da die Vernier-Reste entscheidend für die Ausrichtung der CDRs und damit für die Antigenbindung sind, kann der humanisierte Antikörper mit der höchsten Affinität mittels FACS identifiziert werden. Die Humanisierung wurde sowohl im scFv- als auch im Fab-Format durchgeführt. Next Generation Sequencing nach zwei FACS-Sortierrunden ergab eine Anreicherung bestimmter Vernier-Kombinationen. Die humanisierten Antikörper wurden als scFv-Fc-Fusionen bzw. als Volllängen-IgG-Antikörper hergestellt. Biophysikalische Analysen zeigten eine verbesserte Stabilität und ein verbessertes Aggregationsverhalten bei nahezu gleichbleibender Affinität. Zusätzlich war die Keimbahnidentität vergleichbar mit der von therapeutisch zugelassenen humanisierten Antikörpern. Diese Technologie ermöglicht daher die schnelle und bequeme Humanisierung von Hühner-Antikörpern durch einen generischen Prozess, was Hühner-Antikörper für therapeutische Verwendungen interessant macht.

In der vierten Studie wurde der zuvor generierte EGF-blockierende mAb durch einen neuartigen Leichtketten-Shuffling-Ansatz affinitätsmaturiert. Dieser Ansatz basierte auf dem einbringen von Bindungsstörenden Mutation den CDRs der VH und der Auswahl einer neuen VL-Domäne, welche die Bindung wiederherstellen kann. Diese neue leichte Kette wurde als cLC für eine anti-CD16a- und eine anti-PD-L1-Bibliothek ausgewählt. Der resultierende CD16a-Binder band mit hoher Affinität an beide humanen CD16a-Isotypen und blockierte die Interaktion zu humanem IgG1-Fc. Der PD-L1-Binder wies ein überlappendes Epitop mit Durvalumab, einem von der US-amerikanischen Food and Drug Administration (FDA) zugelassenen anti-PD-L1-Antikörper, auf und blockierte effektiv die Interaktion von PD-1 und PD-L1. Die drei Fab-Fragmente wurden anschließend humanisiert und in einen trispezifischen 2+1-Antikörper reformatiert, wobei eine schwere Kette den anti-EGFR-Fab-Arm trug. Die zweite Schwere Kette bestand aus dem anti-PD-L1-Fab, welcher als „Head-to-Tail“-Fusion mit dem anti-CD16a-Fab verbunden war. Das trispezifische Molekül war in der Lage, alle drei Antigene mit hoher Affinität und zudem auch gleichzeitig zu binden. Durch das gleichzeitige adressieren von EGFR und PD-L1 ermöglichte der trispezifische Antikörper einen verstärkten CD16a-vermittelten ADCC-Effekt im Vergleich zum EGFR×CD16a-bispezifischen Antikörper. Die Verwendung einer common light chain vereinfacht die Herstellung und Entwicklung von humanen 2+1 bi- und trispezifischen Antikörpern und könnte in Zukunft zur Generierung von humanen oligospezifischen therapeutischen Hühner-Antikörpern beitragen.

Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, pH-abhängiges Bindungsverhalten in die common light chain eines bispezifischen CEACAM5×CEACAM6-Antikörpers einzubauen. Dazu wurden zwei Histidine in die CDR-L1 oder in die CDR-L3 oder in beide CDRs der VL IGKV3-15 eingefügt. Eine YSD-Bibliothek wurde nach Antikörpern durchmustert, welche bei pH 7,4 an CEACAM5 binden und bei pH 6,0 nicht binden. Es wurden zwei Leichtkettenvarianten mit pH-abhängigen Bindungseigenschaften isoliert. Durch rationale Permutation der jeweiligen Histidine wurden drei neue Varianten generiert, die eine erhöhte pH-Abhängigkeit aufwiesen, wie mit BLI-Experimenten gezeigt werden konnte. Die leichte Kette, welche die stärkste pH-abhängige Bindung vermittelte, wurde darüber hinaus mit der CEACAM6-bindenden schweren Kette gepaart. Nachfolgende BLI-Experimente zeigten keine pH-Abhängigkeit, was darauf hindeutete, dass die pH-abhängige Bindung nur mit dem VH vermittelt wird, mit dem die leichte Kette ursprünglich isoliert wurde. Es wurde ein bispezifischer Antikörper generiert, der CEACAM5 pH-abhängig und CEACAM6 pH-unabhängig band. Darüber hinaus war der Antikörper in der Lage, über mehrere Zyklen hinweg pH-abhängig CEACAM5 zu binden und wieder zu dissoziieren. Diese Methodik könnte verwendet werden, um zusätzliche Wirkungsweisen in bereits existierende bi- oder multispezifische Leichtketten-Antikörper einzubauen oder um in kurzer Zeit neue pH-abhängige mAbs zu generieren.

Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit neue Methoden zur Generierung humanisierter multispezifischer Antikörper aus Hühnern entwickelt. Es wurden verschiedene Engineering-Strategien aufgezeigt, um Affinitäten zu optimieren und pH-abhängige Spezifität einzubeziehen, was den Weg für maßgeschneiderte Therapeutika ebnet.

Status: Publisher's Version
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-193609
Classification DDC: 500 Science and mathematics > 540 Chemistry
Divisions: 07 Department of Chemistry > Clemens-Schöpf-Institut > Fachgebiet Biochemie
Date Deposited: 20 Sep 2021 07:49
Last Modified: 09 Sep 2022 08:54
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/19360
PPN: 485731541
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