Die Detektion von Biomolekülen ist von entscheidender Bedeutung sowohl in der Diagnostik von Krankheiten wie auch in der Therapeutik und bei Vorsorgeuntersuchungen. In diesem Sinne ermöglicht die Synthetische Biologie die Konstruktion wirkungsvoller Biosensorik-Plattformen auf Basis von molekularen Rezeptoren und Aktuatoren. Ein optimaler Biosensor lässt sich nur durch umsichtiges Design und nach umfassendem Screening identifizieren. In meiner Promotion habe ich mich daher intensiv mit Konstruktionsprinzipien befasst, die es ermöglichen, aus modularen Fusionsproteinen wirkungsvolle Biosensoren zu generieren. Die Proteinlinker zwischen den einzelnen Domänen von Fusionsproteinen sind für die Funktionalität Letzerer zentral. Obwohl diese Bedeutung bekannt ist, existieren bisher nur wenige Methoden, die eine systematische Untersuchung der Linker erlauben. Daher wurde eine neuartige Strategie zur DNA-Assemblierung entwickelt, die das Klonieren umfangreicher Linker-Bibliotheken ermöglicht. Bei der Anwendung dieser Strategie auf synthetische Proteinschalter habe ich mehrere schlagkräftige Proteasen identifiziert, die auf Liganden reagieren. Dass Linker auch in einem anderen Kontext von entscheidender Bedeutung sind, wurde durch die Charakterisierung verschiedener Varianten der β-Fass Transmembran-Nanopore FhuA ΔcΔ5L gezeigt, die in artifiziellen Lipid-Bilayern vermessen wurden. Der Linker zwischen der Transmembran-Domäne und maßgeschneiderten terminalen Rezeptorpeptiden stellte sich als entscheidender Parameter heraus, der sowohl Offenwahrscheinlichkeit als auch die Fähigkeit der Pore, mit anderen Molekülen zu interagieren, beeinflusste. Eine maßgeschneiderte ΔcΔ5L Variante verknüpfte sich irreversibel mit einem zweiten Fusionsprotein, während sie im Bilayer verankert war. Dadurch wurde aufgezeigt, dass das System als Biosensor im Einzelmolekülmaßstab funktioniert. Biologische Nanoporen sind zwar hochspezifisch, aber strukturell anfällig. Daher ist ihr Einsatz in anwendungsorientierten Biosensoren mit Schwierigkeiten verbunden. Als Alternative wurde eine Strategie zur stabilen Immobilisierung von Fusionsprotein-Rezeptoren in ionenspur-geätzten PET-Folien entwickelt, in enger Zusammenarbeit mit Ivana Duznovic aus der Arbeitsgruppe Materialanalytik. Die Anbringung hochspezifischer Nanobodies an konische Nanoporen erlaubte die sensitive Unterscheidung von Analyten durch Strom-Spannungs-Messungen (I-V Messungen). Die entwickelte Nanobody-Nanoporen-Biosensor-Plattform ist hochmodular und potentiell kombinierbar mit der Lab-on-Chip Technologie. Im ersten Kapitel setze ich meine Dissertation in den Kontext von Synthetischer Biologie und Nanosensoren und gehe auf die entsprechenden Berührungspunkte ein, die in den folgenden Kapiteln beschrieben werden. Das zweite Kapitel beschreibt die Entwicklung einer Klonierungsstrategie für Protein-Linker und deren Anwendung anhand synthetischer Proteinschalter. Das dritte Kapitel behandelt die biologische Nanopore ΔcΔ5L, während sich das vierte Kapitel der Enwicklung einer Biosensorik-Plattform auf Basis von Festkörper-Nanoporen widmet.