TU Darmstadt / ULB / TUprints

Proteomic Investigation of Novel Nuclear JAK2 Pathways

Török, Timea (2022):
Proteomic Investigation of Novel Nuclear JAK2 Pathways. (Publisher's Version)
Darmstadt, Technische Universität,
DOI: 10.26083/tuprints-00014460,
[Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Status: Publisher's Version
Title: Proteomic Investigation of Novel Nuclear JAK2 Pathways
Language: English
Abstract:

Myeloproliferative neoplasms represent different cancer entities, which all originate from clonal deregulation of hematopoietic stem cells (HSCs). Most disease entities share the same activating mutation of the tyrosine kinase JAK2. Constitutively activated JAK2-V617F mutated HSCs are thought to promote disease progression by stimulating uncontrolled gene expression through the activation of signal transducers and activators of transcription (STAT). Whereas this canonical JAK2/STAT pathway has been thoroughly investigated, research within the nuclear compartment revealed previously unknown functions of JAK2. The kinase was shown to be involved with other transcription factors like NF1-C2 or RUSH. Moreover, through phosphorylation of histone H3 and subsequent release of HP1a, JAK2 is also responsible for epigenetic regulation. Discovery of these pathways gives rise to the question: which other pathways are influenced by nuclear JAK2? Striving to uncover further mechanisms of nuclear JAK2, I initially utilized mass spectrometric pYome and interactome analyses which led me to the recognition of proteins involved in mRNA splicing as thus far unknown targets: hnRNPA1-Y341&Y347, hnRNPA2B1-Y336&Y347, Raver1-Y303 and SF3b155-Y84. Introducing a mutated hnRNPA1 sequence and applying a CRISPR-Cas9 based approach to knock-out the endogenous one, ensured that phosphorylation of the mentioned tyrosine-residues was inhibited. Through a subsequent RNA-sequencing analysis, the differences in phosphorylated vs. non-phosphorylatable hnRNPA1 transcriptomes were examined. With this, I was able to show that nuclear JAK2 mediated phosphorylation of hnRNPA1-Y341&Y347 aids in activating the NFkB pathway by fostering expression of the easily degradable IkBb-1 isoform. In conclusion, I showed that inhibition of hnRNPA1 phosphorylation led to reduced expression of NFkB target genes.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Myeloproliferative Neoplasien bezeichnen unterschiedliche Krebsarten, die alle klonale Veränderungen der Blutstammzellen gemein haben. Die meisten Arten stehen jeweils mit der gleichen aktivierenden Mutation der Tyrosinkinase JAK2 in Zusammenhang. Es wird davon ausgegangen, dass in Blutstammzellen die konstitutiv aktivierte JAK2-V617F Mutation das Voranschreiten der Erkrankung durch die unkontrollierte Stimulation von STAT Transkriptionsfaktoren fördert. Dieser kanonische JAK2/STAT Signalweg ist bereits ausgiebig untersucht und beschrieben worden. Untersuchungen im Zellkern hingegen, haben bisher unbekannte, nicht-kanonische Signalwege von JAK2 hervorgebracht. Hiernach ist JAK2 unter anderem an der Aktivierung anderer Transkriptionsfaktoren, wie NF1-C2 oder RUSH, beteiligt. Des Weiteren spielt die Kinase, durch Phosphorylierung von Histone H3 und der anschließenden Freisetzung von HP1a, eine Rolle in epigenetischer Genregulation. Die Entdeckung dieser Signalwege wirft daher die Frage auf: welche anderen Signalwege werden von nukleärem JAK2 noch beeinflusst? Bestrebt eben diese aufzudecken, habe ich mir zunächst die massenspektrometrische Untersuchung des JAK2-pYomes und -Interaktomes zu Nutze gemacht. Diese haben zu der Enthüllung von bestimmten Proteinen geführt, welche am mRNA-Splicing beteiligt sind und damit bisher unbekannte JAK2-Substrate darstellen: hnRNPA1-Y341&Y347, hnRNPA2B1-Y336&Y347, Raver1-Y303 und SF3b155-Y84. Mit der Einführung einer modifizierten hnRNPA1 Sequenz und der Anwendung eines CRISPR-Cas9 basierten Gen-Knockouts, habe ich die Erbinformation von hnRNPA1 mutiert, sodass Phosphorylierungen an den genannten Tyrosin-Resten nicht mehr stattfinden konnten. In einer darauffolgenden RNA-Sequenzierungsanalyse, konnten die Unterschiede im Transkriptom von phosphoryliertem und nicht-phosphorylierbarem hnRNPA1 untersucht werden. Hierdurch habe ich aufzeigen können, dass die Phosphorylierung von hnRNPA1-Y341&Y347, durch nukleäres JAK2, die Aktivierung des NFkB-Signalweges unterstützt, indem die Expression der leicht degradierbaren IkBb-1 Isoform gefördert wird. Abschließend konnte ich verdeutlichen, dass die Hemmung von phosphoryliertem hnRNPA1 zu einer Minderung in der Expression von NFkB Zielgenen führt.

German
Place of Publication: Darmstadt
Collation: 131 Seiten
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 01 Feb 2022 13:23
Last Modified: 01 Feb 2022 13:24
DOI: 10.26083/tuprints-00014460
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-144609
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M. Cristina ; Löwer, Prof. Dr. Alexander
Date of oral examination: 16 February 2021
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/14460
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