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Elucidation of the epigenetic code of the chromosomal region 13q14.3 in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)

Ruppel, Melanie (2009)
Elucidation of the epigenetic code of the chromosomal region 13q14.3 in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).
Technische Universität
Ph.D. Thesis, Primary publication

Copyright Information: CC BY-NC-ND 2.5 Generic - Creative Commons, Attribution, NonCommercial, NoDerivs .

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Item Type: Ph.D. Thesis
Type of entry: Primary publication
Title: Elucidation of the epigenetic code of the chromosomal region 13q14.3 in Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL)
Language: English
Referees: Göringer, Prof. Dr. H. Ulrich ; Lichter, Prof. Dr. Peter ; Löbrich, Prof. Dr. Markus
Date: 28 March 2009
Place of Publication: Darmstadt
Date of oral examination: 19 February 2009

B-cell chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia among adults in the Western world with a median age of 72 years of CLL patients at diagnosis. The most common genomic aberration in CLL is the deletion of a critical region in chromosomal band 13q14.3, which is deleted in more than 50 % of patients. The high frequency of deletions of 13q14.3 in CLL and other tumors points to a tumor suppressor mechanism localized in the critical region. The candidate genes localized in the critical region in 13q14.3 have been shown to be monoallelically expressed. Towards elucidation of the tumor suppressor mechanism in 13q14.3, the epigenetic modifications of genes and CpG-islands in the region were analyzed in this thesis. Monoallelic expression of almost all genes in the critical region in 13q14.3 in non-malignant cells was detected to be marked by epigenetic modifications at promoter and exonic regions of these genes. A chromatin pattern specific for monoallelically expressed and imprinted genes, which is promoter-restricted enrichment of dimethylated lysine 4 of histone H3 (H3K4me2), was detected at the genes DLeu2/BCMSUN and C13ORF1. Detection of this specific chromatin pattern led to identification of a novel monoallelically expressed gene in the region: C13ORF1. Here, C13ORF1 was in addition to RFP2 and DLeu2/BCMSUN, shown to be monoallelically expressed in B- and T-cells from healthy donors. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) methodology was established in order to quantify two chromatin modifications at the critical region. ChIP was technically established and optimized to analyze enrichment of the histone mark H3K4me2 that is correlated with an active transcription state, and of the histone variant macroH2A, which was shown to be allelically enriched at monoallelically silenced loci, at 13q14.3. In addition, also DNA-methylation of the CpG-islands was analyzed. Thus, an epigenetic code of the candidate genes that correlates with their transcription status was determined in non-malignant hematopoietic and CLL cells. In non-malignant cells, the epigenetic code identifies one active and one inactive copy of the critical region in 13q14.3. Thereby, the genes DLeu2/BCMSUN and C13ORF1 are monoallelically expressed from the epigenetically active allele and their expression status is marked by a distinct chromatin pattern. In contrast, the distinct chromatin pattern could not be detected at the gene RFP2 that was earlier shown to be monoallelically expressed. The quantification of H3K4me2 and macroH2A occurrence at RFP2 points to allelic differences of enrichment at the gene locus, although this could not be further defined by the chosen methods. However, allelic enrichment of chromatin marks could be detected at two distinct loci in the 5’-regions of the large noncoding RNA genes, BCMS and DLeu2/BCMSUN, in samples derived from healthy probands. Thereby, in this study, two candidate locus control regions (LCRs) were identified that are located in the CpG-islands D and E in the promoter region of the two large ncRNAs and showed differential DNA-methylation and histone modifications. The differential epigenetic code and the localization of the candidate LCRs suggest their involvement in the regulation of expression of the two large ncRNA genes that span the critical region in 13q14.3. In summary these findings suggest a model of the epigenetically regulated tumor suppressor mechanism in 13q14.3 that leads to monoallelic expression of the candidate genes in the region. This model consists of the features that i) 13q14.3 is present in one active and one silent chromosome copy in non-malignant healthy cells, ii) the large ncRNAs BCMS and BCMSUN are likely involved in the regulation (in cis) of expression of the other genes in 13q14.3, and iii) differential epigenetic modifications of candidate LCRs control transcription of the large ncRNA genes. Accordingly, the epigenetic status of the LCRs is critical for transcription of the ncRNAs that in turn regulate the expression of the candidate genes in the critical region. Surprisingly, the most evident epigenetic aberration at 13q14.3 was the generally higher enrichment of the active chromatin mark at the region in CLL cells. However, also the inactive chromatin mark was increased at 13q14.3 in CLL cells. Significant differences of enrichment of H3K4me2 and macroH2A between non-malignant and CLL cells, were detected at CpG-islands B, C and E and at the exonic region of DLeu2/BCMSUN, which clearly showed that the aberrant modifications in CLL are most evident at the promoter regions of the genes C13ORF1, RFP2 and DLeu2/BCMSUN, respectively. The chromatin pattern that marks monoallelic expression at C13ORF1 and DLeu2/BCMSUN remained unchanged in the analyzed CLL cells. However, in CLL cells derived from patients with different genomic aberrations, the deletion of genomic material from 13q14.3 and loss of active chromatin marks could be correlated. This suggests that in del(13q) CLL patients, indeed the active copy of 13q14.3 is lost, which would explain downregulation of expression of the genes in the critical region observed in these patients. In line with the proposed model of the tumor suppressor mechanism in 13q14.3, the most evident aberrant epigenetic modifications of 13q14.3 in CLL cells were detected at the two candidate LCRs, where distinct epimutations were detected. Thus, an epimutation in 13q14.3 was shown that could be responsible for the inactivation of the epigenetic regulatory mechanism of 13q14.3 in CLL cells. Further, these findings suggest that the regulatory impact of the ncRNAs, the LCR or another yet unidentified part of the critical region in 13q14.3 is affected by this epimutation, which leads to deregulation and inactivation of the tumor suppressive function of 13q14.3. In conclusion, a specific epigenetic code at the genes in the critical region in 13q14.3 was determined that is correlated with their transcriptional state. Evidence was obtained for a model of epigenetic regulation that implies differential chromatin packaging of the two copies of 13q14.3 and results in monoallelic expression of the candidate genes in healthy B- and T-cells. Furthermore, two candidate LCRs were identified in the critical region in 13q14.3 in non-malignant cells that showed distinct epimutations in CLL cells. The localization and the detected epimutations of the LCRs in CLL point to their role in regulation of the ncRNA genes that most likely regulate expression of the other genes in the critical region. On the basis of these findings, further characterization of epigenetic features at 13q14.3 will help to fully elucidate the complex epigenetic regulatory network that controls the tumor suppressor mechanism in 13q14.3. The findings presented here will help to understand the pathogenicity of (epigenetic) inactivation of the tumor suppressor mechanism in CLL and thereby provide the basis for development of more efficient and specific therapies for CLL in the future.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage

Die chronisch lymphatische Leukämie des B-Zell Typs (B-CLL) ist in den westlichen Ländern die am häufigsten auftretende Leukämie bei Erwachsenen. Durchschnittlich sind die Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose 72 Jahre alt. Die häufigste genomische Veränderung bei Patienten ist die Deletion einer kritischen Region in der chromosomalen Bande 13q14.3, die bei über 50 % aller B-CLL Patienten auftritt. Die Häufigkeit des Verlusts der kritischen Region in 13q14.3 in B-CLL und anderen Tumoren deutet auf einen wichtigen Tumorsuppressormechanismus hin, der in der kritischen Region lokalisiert ist. Außerdem konnte bisher für fast alle Kandidatengene der Region 13q14.3 monoallelische Expression nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurden epigenetische Modifikationen an Genen und CpG-Inseln der chromosomalen Region untersucht, um zur Aufklärung des Tumorsuppressormechanismus beizutragen. Die monoallelische Genexpression der kritischen Region in 13q14.3 ist durch epigenetische Modifikationen des Chromatins der Promotoren und Genregionen markiert. Ein Chromatinmodifikationsmuster, das spezifische monoallelisch exprimierte und auch geprägte Gene markiert, ist die Anreicherung von dimethyliertem Lysin 4 des Histons H3 (H3K4me2), die eng auf den Promoterbereich begrenzt ist. Dieses spezifische Muster wurde an den Genen C13ORF1 und DLeu2/BCMSUN entdeckt und führte zur Identifizierung eines weiteren monoallelisch exprimierten Gens der Region 13q14.3. Zusätzlich zu den bereits gezeigten Genen RFP2 und DLeu2/BCMSUN, konnte auch für C13ORF1 eine monoallelische Expression in gesunden B- und T-Zellen gezeigt werden. Die Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Methode wurde etabliert, um zwei Chromatinmodifikationen an der chromosomalen Bande 13q14.3 zu quantifizieren. Hierfür musste die ChIP-Methode zunächst technisch etabliert und optimiert werden, um die Anreicherung von H3K4me2, was mit einem aktiven Transkriptionsstatus korreliert, und von der Histonvariante macroH2A, welche mit einem reprimiertem Transkriptionsstatus und allelisch unterschiedlicher Anreicherung korreliert, analysieren zu können. Zusätzlich wurde auch die DNA-Methylierung der Region 13q14.3 untersucht. Auf diese Weise wurde der epigenetische Code der Kandidatengene, der mit deren Transkriptionsstatus korreliert ist, in gesunden hämatopoetischen Zellen und in B-CLL Zellen identifiziert. In gesunden hämatopoetischen Zellen markieren die epigenetischen Modifikationen eine aktive und eine inaktive Kopie der kritischen Region in der chromosomalen Bande 13q14.3. Die Gene C13ORF1 und DLeu2/BCMSUN werden allein von der aktiven Kopie exprimiert und ihr monoallelischer Transkriptionsstatus ist im Chromatin markiert. Für das bereits als monoallelisch exprimiert beschriebene Gen RFP2 konnte dieses spezifische Chromatinmuster in der vorliegenden Arbeit nicht gefunden werden. Allerdings deutet die Quantifizierung von H3K4me2 und macroH2A darauf hin, dass es auch an diesem Genlocus allelische Unterschiede gibt, welche mit der angewendeten Methode jedoch nicht näher definiert werden konnten. Im Gegensatz zum RFP2 Locus, konnte eine allelische Anreicherung der untersuchten Chromatinmodifikationen an zwei definierten Loci in der 5’-Region der nichtkodierenden RNA (ncRNA) Gene, BCMS und DLeu2/BCMSUN, in gesunden Zellen gezeigt werden. Mittels der in der vorliegenden Studie definierten, allelisch unterschiedlichen Anreicherung der Histonmodifikationen und auch der DNA-Methylierung, wurden zwei Kandidaten-Locus-Kontroll-Regionen (LCR) identifiziert, die in den CpG-Inseln D und E in den Promoterregionen der beiden großen ncRNA Gene lokalisiert sind. Ihr differentieller epigenetische Code sowie die Lokalisierung der Kandidaten-LCRs spricht für ihre Beteiligung an der Expressionsregulation der beiden ncRNA Gene, die die gesamte kritische Region überspannen. Zusammenfassend führen diese Ergebnisse zu einem Model des epigenetisch regulierten Tumorsuppressormechanismus in 13q14.3, der zur monoallelischen Expression der Kandidatengene führt. Das Model besteht bisher aus drei ermittelten Merkmalen: i) die chromosomale Region 13q14.3 liegt in einer aktiven und einer inaktiven Kopie in gesunden hämatopoietischen Zellen vor, ii) die großen ncRNA Gene, BCMS und DLeu2/BCMSUN, sind wahrscheinlich an der Expressionsregulation der anderen Gene der Region (in cis) beteiligt und iii) die differentiellen epigenetischen Modifikationen der Kandidaten-LCRs kontrollieren die Transkription der großen ncRNA Gene. Somit wäre der epigenetische Status der LCRs entscheidend für die Transkription der ncRNA Gene, welche wiederum die Expression der Kandidatengene regulieren. In B-CLL Zellen war die auffälligste epigenetische Aberration in 13q14.3 ein allgemein starker Anstieg der Anreicherung der aktivierenden aber auch der repressiven Chromatinmarkierung. Signifikante Unterschiede in der Anreicherung von H3K4me2 und macroH2A zwischen gesunden und B-CLL Zellen wurden an den CpG-Inseln B, C und D, sowie an der exonischen Region des Gens DLeu2/BCMSUN gefunden. Dies zeigte klar, dass aberrante Modifikationen in B-CLL am deutlichsten an den Promoterregionen der Gene C13ORF1, RFP2 und DLeu2/BCMSUN auftreten. Das Chromatinmodifikationsmuster, das die monoallelisch exprimierten Gene C13ORF1 und DLeu2/BCMSUN markiert, blieb in den analysierten B-CLL Zellen unverändert bestehen. Darüber hinaus konnte in B-CLL Zellen von Patienten mit unterschiedlichen genomischen Aberrationen die Deletion von genomischem Material der chromosomalen Region 13q14.3 mit dem Verlust der aktivierenden Chromatinmarkierungen korreliert werden. Dies deutet darauf hin, dass tatsächlich die aktive Kopie von 13q14.3 in monoallelisch deletierten Patienten mit B-CLL verloren gegangen ist, was auch die starke Herunterregulierung der Genexpression in der kritischen Region erklärt, die in diesen Patienten beobachtet wurde. In Übereinstimmung mit dem Modell des Tumorsuppressormechanismus in 13q14.3 wurde die auffälligste epigenetische Aberration an 13q14.3 in B-CLL Zellen an den Kandidaten-LCRs gefunden. Somit wurde eine Epimutation in 13q14.3 entdeckt, die für die Inaktivierung des Tumorsuppressormechanismus in 13q14.3 in B-CLL Zellen verantwortlich sein könnte. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen weiterhin, dass der regulatorische Einfluss der ncRNAs, der LCRs oder einem anderen noch nicht näher identifizierten Bereichs der kritischen Region in 13q14.3 von dieser Epimutation betroffen sein könnte, und diese so zur Deregulierung und Inaktivierung der Tumorsuppressorfunktion in 13q14.3 führt. Zusammenfassend konnte ein spezifischer epigenetischer Code der Gene in der kritischen Region in 13q14.3 identifiziert werden, der mit deren Transkriptionsstatus korreliert. Die hier gefundenen Ergebnisse unterstützen das Modell der epigenetischen Regulation, das differentielle Chromatinverpackung der beiden Kopien von 13q14.3 einschließt und zur monoallelischen Expression der Kandidatengene in gesunden B- und T-Zellen führt. Zusätzlich konnten zwei Kandidaten-LCRs in den Promoterregionen der beiden großen ncRNA Gene in der kritischen Region identifiziert werden, die distinkte Epimutationen in B-CLL Zellen aufweisen. Die Lokalisierung sowie die gefundenen Epimutationen der LCRs in B-CLL deuten auf eine wichtige Rolle der LCRs bei der Transkriptionsregulation der großen ncRNA Gene hin, die wahrscheinlich die Genexpression in der kritischen Region regulieren. Auf Basis der vorliegenden Ergebnisse ist nun eine weitere Charakterisierung des komplexen epigenetischen Netzwerks möglich, das den Tumorsuppressormechanismus in 13q14.3 kontrolliert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie tragen dazu bei, die Pathogenität der epigenetischen Inaktivierung des Tumorsuppressormechansimus in B-CLL zu verstehen und können somit eine Basis für die zukünftige Entwicklung von effizienteren und spezifischeren Therapien der B-CLL bilden.

URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-13549
Classification DDC: 600 Technology, medicine, applied sciences > 610 Medicine and health
500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 06 Apr 2009 08:43
Last Modified: 08 Jul 2020 23:18
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/1354
PPN: 211246689
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