Optogenetik bietet einzigartige Möglichkeiten, zelluläre Funktionen durch die Verwendung von lichtsensitiven Proteinen mit hoher zeitlicher und räumlicher Präzision zu kontrollieren. Diese lichtsensitiven Proteine können in zwei Gruppen eingeteilt werden: Die erste Gruppe umfasst Proteine welche Retinal enthalten, die als lichtinduzierbare Pumpen oder Kanäle fungieren. Die zweite Gruppe umfasst modulare Photoaktivatoren in welchen durch Licht Konformationsänderungen verursacht werden, welche wiederum die Interaktion mit einer Effektor-Domäne verursachen. Hauptsächlich findet Optogenetik Verwendung in der Untersuchung von erregbaren Zellen und bietet großes Potential für neuartige Behandlungsmöglichkeiten für viele Krankheiten, wie neurologische Störungen oder durch Abbau von Photorezeptoren verursachte Blindheit. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene optogenetische Werkzeuge, basierend auf Kaliumkanälen, entwickelt, optimiert und auf ihre Funktionalität untersucht. Das Ziel war die Expression GFP-markierter Kaliumkanäle in der Plasmamembran oder den Mitochondrien von Säugerzellen. In der Plasmamembran können Kaliumkanäle als optogenetische Silencer fungieren, da sie die Zellen hyperpolarisieren und damit das Feuern von Aktionspotentialen verhindern. Um diese Effekte zu untersuchen, wurden zwei Kaliumkanäle verwendet: KcvPBCV-1 und KcvNTS. Bei einer lichtinduzierten Expression von Kaliumkanälen in den Mitochondrien ermöglicht die induzierbare Depolarisation die Untersuchung der Wirkung von Kaliumkanälen in den Mitochondrien. Für die Untersuchung dieser Fragestellung wurden die Kaliumkanäle Kesv und Kmpv12T verwendet.

Um die Sortierung der vier verwendeten Kaliumkanäle zu optimieren, wurden zwei verschiedene Wege zur Maximierung der Sortierungseffizienz in Säugerzellen angewendet. Die Optimierung der verwendeten Codone, durch Austausch von Seltenen gegen häufig verwendete Codone, führte zu einer verbesserten Sortierung der Kanäle in die Mitochondrien. Vor allem bei Kesv führte dieses Vorgehen zu einer effektiveren Sortierung in die Mitochondrien. Auch eine Verkürzung des Proteinlinkers zwischen Kanal und GFP führte zu einer vermehrten Sortierung von Kesv in die Mitochondrien. Die Kombination dieser beiden Herangehensweisen – ein codonoptimierter Kanal in Verbindung mit einem verkürzten Linker – führte zu einer hundertprozentigen Sortierung von Kesv in die Mitochondrien. Der positive Effekt dieser beiden Herangehensweisen konnte in sechs verschiedenen Säugerzelllinien nachgewiesen werden und legt damit einen generellen Sortierungsmechanismus in Säugerzellen nahe. Für den an die Plasmamembran sortierten Kanal KcvPBCV-1 konnte kein Effekt von Codonoptimierung auf die Sortierungseffizienz nachgewiesen werden. Im Unterschied zu den mitochondrialen Kanälen, ist für eine optimale Sortierung der an der Plasmamembran exprimierten Kanäle ein niedriges Expressionslevel von Vorteil.

Für das Design eines optogenetischen Tools zur kurzzeitigen Depolarisation der Mitochondrien wurden verschiedene Änderungen am bestehenden lichtschaltbaren Kaliumkanal BLINK1 vorgenommen. Durch das Hinzufügen von sechs kanonischen mitochondrialen Sortierungssignalen am N-Terminus konnte eine effektive Sortierung des Kanals an die Mitochondrien erreicht werden. Die funktionellen Eingenschaften dieses Konstrukts müssen noch überprüft werden. In einer alternativen Strategie wurden optogenetische Werkzeuge zur Langzeitaktivierung von Kaliumkanälen in der Plasmamembran oder den Mitochondrien entwickelt. In diesem Fall wurden zwei verschiedene lichtinduzierbare Genexpressionssysteme eingesetzt, um die Expression geeigneter Kaliumkanäle durch Licht zu regulieren. Der erste Ansatz basierte auf der Dimerisierung der bakteriellen Light-Oxygen-Voltage-Domäne aus Erythrobacter litoralis (EL222). Das zweite System basierte auf der lichtgesteuerten Interaktion von Cryptochrome 2 (CRY2) mit seinem Interaktionspartner CIB1. In diesen Experimenten wurde die Expression eines GFP-markierten Kaliumkanals unter Kontrolle des EL222-Systems untersucht. Anhand der Intensität des GFP-Signals in den transfizierten Zellen wurde deutlich, dass der Kanal bereits im Dunkeln signifikant exprimiert wurde und eine sehr hohe Lichtintensität (120 µE für 16 Stunden) benötigte, um die Expression über das Dunkelniveau zu heben. Aufgrund dieser Kombination aus unspezifischer Leck-Expression im Dunkeln und hohem Lichtbedarf wurde das EL222-System nicht weiter untersucht. In einem alternativen System wurde die Kaliumkanalexpression durch das Blaulicht-induzierte Rezeptorsystem CRY2/CIB1 aus Arabidopsis thaliana kontrolliert. Dieses lichtempfindliche Transkriptionssystem erwies sich als wirksam für die lichtinduzierbare Kaliumkanalexpression. Es benötigte sehr niedrige Lichtintensitäten (6 µE für 1 Stunde) oder kurze Belichtungszeiten mit höherer Lichtintensität für eine robuste Expression des Kandidatenkanals. Ein 5-Sekunden-Impuls von 120 µE war bereits ausreichend für eine maximale Stimulation der Kanalexpression. Die unspezifische Expression des Kanals im Dunkeln lag kaum über dem Detektionsminimum. Es war auch möglich, die Handhabung des Systems zu vereinfachen, indem alle drei notwendigen Komponenten (CRY2, CIB1, Kaliumkanal) in einen Expressionsvektor kloniert wurden, ohne die Wirksamkeit des Systems zu beeinträchtigen. Eine Stunde gepulstes Licht (6 µE) war ausreichend, um eine Stunde nach der Lichtstimulation die volle Aktivierung der Kanalexpression zu erreichen. Das CRY2 CIB1-System wurde in verschiedenen funktionellen Assays untersucht. Die Eigenschaften von Kanälen, die an der Plasmamembran lichtabhängig exprimiert wurden, wurden durch whole-cell Patch-Clamp-Messungen bestätigt. Die Daten zeigen, dass die Kanäle, die unter Kontrolle des CRY2 CIB1-Systems exprimiert wurden, die Plasmamembran erreichten und dort die gleichen funktionellen Eigenschaften wie die konstitutiv exprimierten Kontrollkanäle zeigten. Die Funktionalität der Kanäle, die in der inneren Mitochondrienmembran exprimiert werden, wurde sowohl in planaren lipid bilayer Experimenten, als auch durch eine Reihe von Mikroskopie-Assays untersucht. Durch die Verwendung von Fluoreszenzreportern zur Untersuchung der mitochondrialen Membranspannung und der mitochondrialen Kalziumkonzentration konnte gezeigt werden, dass die Expression von mitochondrialen Kaliumkanälen unter Kontrolle des CRY2 CIB1-Systems eine effektive Depolarisierung dieser Organellen bewirkt. Auch der mitochondrialen Kalziumspiegel zeigte eine Verringerung, eine Induktion von Apoptose wurde aber nicht beobachtet. Derzeit werden die CRY2 CIB1-Konstrukte in vivo funktionellen Tests unterzogen, um zu untersuchen, ob sie die Entwicklung von Zebrafischlarven beeinflussen, wenn sie in verschiedenen Organsystemen exprimiert werden.