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Biopolymeric scaffold to achieve high drug-to-antibody ratios using site specific conjugation strategies

Ebenig, Aileen (2019):
Biopolymeric scaffold to achieve high drug-to-antibody ratios using site specific conjugation strategies.
Darmstadt, Technische Universität,
[Ph.D. Thesis]

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190906 PhD Thesis Final.pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Biopolymeric scaffold to achieve high drug-to-antibody ratios using site specific conjugation strategies
Language: English
Abstract:

Commercial antibody-drug conjugates (ADCs) are usually generated by unspecific conjugation of a toxic payload via random lysine or interchain cysteine residues within the antibody, thus leading to heterogeneous products and potential impaired target binding. As the number and conjugation site of a toxic payload influences the efficacy, immunogenicity, and pharmacokinetics of an ADC, various site-specific approaches have been to date developed, among them usage of unnatural amino acids and enzyme mediated conjugation strategies. Recent research deals with increasing drug-to-antibody ratios (DARs), as high DAR can improve the efficacy, especially against cells with low copy number of surface-presented target protein. However, high DARs come along with increasing hydrophobicity that results in aggregation of the ADC and its fast clearance from the body, thus reducing the efficacy. Hydrophilic linker, particular payload design or the usage of biocompatible hydrophilic scaffolds carrying the toxic payload enhance the solubility and decrease aggregation of ADCs with dense payloads. Within the presented work, generation of ADCs enabling high DAR by utilizing polypeptide based scaffolds was investigated, as these constructs offer the possibility of genetic fusion and enzyme-mediated conjugation with an antibody. Genetic fusion with the model antibody trastuzumab was achieved by using the hydrophilic PASylation pattern containing mTG-recognition motifs or intrinsically unstructured regions/polypeptides. These antibody fusions were characterized according to their binding characteristics, stability, and ability to serve as scaffolds for drug conjugation using microbial transglutaminase (mTG). mTG mediated labeling ensured site-specific modification and homogenous product formation. Therefore, nature-derived mTG-recognition motifs were investigated and an optimized sequence was found for the efficient conjugation of a cargo that may facilitate generation of high-payload ADCs in future. Notably, none of the producible antibody fusions showed significantly impaired target binding. However, poor mTG mediated conjugation and instability of the disordered sequences were observed for some trastuzumab fusions. Despite the fact that additives, like EDTA and sodium azide, were used to stabilize the PAS fusions, degradation was observed within several days. As disordered sequences are particularly susceptible to proteolytic degradation, a structured protein was fused to trastuzumab instead, resulting in a stable, though poorly mTG addressable, fusion protein that possessed similar binding characteristic compared to the parental antibody. As an alternative route for the generation of antibodies endowed with a polypeptide sequence that contains a defined number of anchor points for chemical conjugation of a cytotoxic payload, PAS derived constructs were generated via expression in E. coli and linked to the antibody produced in mammalian cell culture using sortase A (SrtA)-mediated conjugation. The conjugation product showed similar target binding characteristics as the wildtype protein. However, chemical modification of PAS-derived polypeptides as well as their purification and analysis remain challenging, thus optimization is mandatory for further applications.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die derzeit auf dem Markt befindlichen Antikörper-Wirkstoff-Konjugate (ADCs - Antibody drug conjugates) wurden durch unspezifische Konjugation eines Wirkstoffs mit Lysin- oder Cysteinseitenketten innerhalb des Antikörpers erzeugt. Diese unspezifische Konjugationsmethode führt zu einem heterogenen Produkt und kann die Bindefähigkeit des Antikörpers beeinträchtigen, wenn die Konjugation innerhalb von Sequenzabschnitten stattfindet, die für die Bindung an die Zielstruktur essentiell sind. Da die Anzahl und die Konjugationsstelle die Wirksamkeit, Immunogenität und Pharmakokinetik eines ADC beeinflusst, wurden verschiedene ortsspezifische Konjugationsstrategien entwickelt, darunter die Verwendung von unnatürlichen Aminosäuren und enzymatisch vermittelten Konjugationsstrategien. Neuere Forschungsarbeiten befassen sich mit steigenden Wirkstoff-Antikörper-Verhältnissen (DARs – Drug-to-antibody ratios), da ein hohes DAR die Wirksamkeit insbesondere gegenüber Zellen mit geringer Anzahl von oberflächenpräsentierten Zielproteinen verbessern kann. Allerdings gehen hohe DARs mit zunehmender Hydrophobizität einher. Dies führt zur Aggregation des ADC und seiner schnellen Entfernung aus dem Körper, wodurch sich die Wirksamkeit des ADC verringert. Hydrophile Linker- oder Wirkstoffderivate, sowie die Verwendung von biokompatiblen, hydrophilen Gerüsten, an welche die toxische Substanz gekoppelt ist, verbessern die Löslichkeit und verringern die Aggregation von ADCs mit hohem DAR. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Herstellung von ADCs mit hohem DAR unter Verwendung von Polypeptid-basierten Gerüsten. Diese genetisch codierbaren Sequenzen bieten die Möglichkeit einer genetischen Fusion und enzymatisch vermittelten Konjugation mit einem Antikörper. Die genetische Fusion mit dem Modellantikörper Trastuzumab wurde durch Verwendung der hydrophilen PAS-Sequenz, welche mit mTG Erkennungssequenzen ausgestattet wurde, oder intrinsisch unstrukturierten Regionen/Polypeptiden erreicht. Diese Antikörperfusionen wurden nach ihren Bindungseigenschaften, ihrer Stabilität und ihrer mTG Reaktivität charakterisiert. Die durch mTG vermittelte Markierungsreaktion gewährleistete die ortsspezifische Modifikation und die Bildung eines homogenen Produkts. Dafür wurden aus der Natur abgeleitete mTG Erkennungsmotive untersucht und eine optimierte Sequenz für die effiziente Konjugation identifiziert, die in Zukunft die Erzeugung von ADCs mit hohem DAR ermöglichen kann. Keines der produzierbaren Antikörperfusionen zeigte eine signifikante Beeinträchtigung der Bindefähigkeit. Allerdings war die mTG vermittelte Konjugationseffizienz bei den meisten Trastuzumab-Fusionen gering. Zudem konnte der Abbau der ungeordneten Sequenzen beobachtet werden. Auch nach Zugabe verschiedener Additive wie EDTA und Natriumazid zur Stabilisierung der PAS-Fusionen, konnte der Abbau innerhalb weniger Tage beobachtet werden. Da ungeordnete Sequenzen besonders anfällig für proteolytischen Abbau sind, wurde stattdessen ein strukturiertes Protein mit Trastuzumab fusioniert, was zu einem stabilen, aber schwer durch mTG markierbaren Fusionsprotein führte, das im Vergleich zum Wildtyp Antikörper ähnliche Bindungseigenschaften aufwies. Für einen alternativen Ansatz zur Herstellung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten, die eine Polypeptidsequenz mit einer definierten Anzahl von reaktiven Seitenketten für die chemische Konjugation eines Toxins enthält, wurden PAS-abgeleitete Sequenzen in E. coli exprimiert und mit dem in der Zellkultur produzierten Antikörper unter Verwendung der Sortase A (SrtA) vermittelten Konjugation ortsspezifisch verknüpft. Das Konjugationsprodukt zeigte ähnliche Bindungseigenschaften wie der Wildtyp-Antikörper. Die chemische Modifikation von PAS-basierten Polypeptiden sowie deren Reinigung und Analyse bleiben jedoch eine Herausforderung, so dass deren Optimierung für weitere Anwendungen unerlässlich ist.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie
07 Department of Chemistry > Fachgebiet Biochemie > Allgemeine Biochemie
Date Deposited: 16 Sep 2019 12:21
Last Modified: 09 Jul 2020 02:37
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-87378
Referees: Kolmar, Prof. Dr. Harald and Neumann, Prof. Dr. Siegfried
Refereed: 15 July 2019
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8737
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