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Industrial biotechnology aims to replace production processes based on petrochemicals with more sustainable biological processes based on renewable raw materials. With the rise of metabolic engineering and synthetic biology in the last decades, the range of products attainable by this technology has widened substantially. This thesis explores the potential of Saccharomyces cerevisiae for the production of two commercially interesting compound classes within the plant polyphenols.
The first part demonstrates heterologous production of various dihydrochalcones. A side activity of the native ScTsc13, the reduction of p-coumaroyl-CoA to p- dihydrocoumaroyl-CoA, was used for de novo production of phloretin, the first committed dihydrochalcone. By further extension of the pathway from phloretin, by employing decorating enzymes with known specificities for dihydrochalcones, and by exploiting substrate flexibility of enzymes involved in flavonoid biosynthesis, de novo production of the antioxidant molecule nothofagin, the antidiabetic molecule phlorizin, the sweet molecule naringin dihydrochalcone, and 3-hydroxyphloretin was achieved.
In the second part, yeast was engineered for de novo production of anthocyanins, molecules that are used in the food and beverage industries as natural colorants. Enzymes from different plant sources were screened and efficient variants were found for most steps of the pathways to the three main anthocyanins. However, as previously shown in vitro and in Escherichia coli, the shunt flavonol production by the anthocyanidin synthase was a major limitation.
In the third part, this flavonol by-product formation was eliminated by co- expression of glutathione-S-transferases. These enzymes, previously thought to be involved in vacuolar transport of anthocyanins in plants, were shown to be required for correct product formation by anthocyanidin synthases. By additional co-expression of glycosyltransferases and a malonyltransferase, the pathway was extended to various decorated anthocyanins with a range of different colors.
This thesis uncovers and describes important steps towards a sustainable biotechnological process for production of dihydrochalcones and anthocyanins. However, further optimization to increase titers will be required before such processes become commercially viable. |
| Alternative Abstract: |
| Alternative Abstract | Language |
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Die industrielle Biotechnologie ermöglicht es, petrochemische Produktionsprozesse durch nachhaltigere biologische Prozesse auf Basis von nachwachsenden Rohstoffen zu ersetzen. In den letzten Jahrzehnten hat sich mit dem Aufkommen von Metabolic Engineering und der synthetischen Biologie das Produktspektrum der industriellen Biotechnologie erheblich erweitert. Diese Dissertation untersucht das Potenzial von S. cerevisiae zur Herstellung von zwei kommerziell interessanten Stoffklassen, die zu den pflanzlichen Polyphenolen gehören.
Der erste Teil zeigt die heterologe Produktion von verschiedenen Dihydrochalconen. Zur de novo Produktion von Phloretin, dem Ausgangsmolekül der meisten Dihydrochalconen, wurde die Reduktion von p-cumaryl-CoA zu p- dihydrocumaryl-CoA durch ScTsc13 verwendet, eine Nebenaktivität dieser endogenen Doppelbindungsreduktase. Der Stoffwechselweg wurde dann unter Verwendung von Enzymen mit bekannten Spezifitäten und durch Ausnutzung der Substratflexibilität von Enzymen, die an der Flavanoidbiosynthese beteiligt sind, zum antioxidativen Molekül Nothofagin, zum antidiabetischen Molekül Phloridzin, zum Süßstoff Naringin Dihydrochalcon und zu 3-Hydroxyphloretin erweitert.
Im zweiten Teil wurde gezeigt, dass Hefe zur de novo Produktion der drei wichtigsten Anthocyanen, welche in der Lebensmittel- und Getränkeherstellung Anwendungen als natürliche Farbstoffe haben, verwendet werden kann. Enzyme aus verschiedenen Pflanzen wurden getestet und effiziente Varianten für die meisten Schritte des Stoffwechselwegs wurden gefunden. Wie zuvor schon für in vitro Reaktionen und in E. coli gezeigt wurde, war die Akkumulation der Flavonol Nebenprodukte aufgrund der Anthocyanidinsynthase auch in Hefe das Hauptproblem.
Im dritten Teil wurde die Bildung der Flavonol Nebenprodukte durch die Koexpression von Glutathion-S-Transferasen eliminiert. Für diese Enzyme wurde vorher angenommen, dass sie am vakuolären Transport von Anthocyanen in Pflanzen beteiligt sind. Sie werden jedoch für die korrekte Produktbildung der Anthocyanidinsynthase benötigt. Durch zusätzliche Expression von Glykosyltransferasen und einer Malonyltransferase konnten wir die de novo Produktion von verschieden dekorierten Anthocyaninen mit unterschiedlichen Farben zeigen.
Diese Dissertation ist ein wichtiger Schritt zu einer nachhaltigeren biotechnologischen Produktion von Dihydrochalconen und Anthocyaninen in Hefe. Um die notwendigen Produktionstiter für einen kommerziell umsetzbaren Prozess zu erreichen sind jedoch noch weitere Optimierungen erforderlich. | German |
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