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Worldwide, mistletoe plants are important forest pests, found in all continents aside from Antarctica. In North America, control of conifer parasitism by dwarf mistletoes, specifically Arceuthobium americanum, is challenging. Dwarf mistletoes are dioecious parasitic flowering plants with a unique and effective explosive seed dispersal mechanism. Due to the large accumulation of water within the fruit, which increases both the fruit size and its internal hydrostatic pressure, the transport of water into the fruit and the possible involvement of plasma membrane intrinsic proteins (PIPs), particularly aquaporins (AQPs), were the focus of the investigation. Notably, previous research also demonstrated that cuticle thickening, declining stomata number, and thermogenesis are potential “players” in forcible discharge. As such, molecular work was performed here to reveal genes involved in physiological processes potentially associated with explosive seed dispersal and to examine the expression of these genes. Therefore, the overarching goal of this project was to obtain gene sequencing and expression data for Arceuthobium spp. to gain insights into the involvement of AQPs and other proteins likely responsible for generating high hydrostatic pressure and discharge. Many methods were employed to extract the RNA from the fruit, including both traditional and commercially available methods, and following successful extraction, a cDNA library was constructed. A non-standard heterologous microarray hybridization, unconventionally used for transcription analysis of non-model species, employing both the MicroCASTer handheld system and an Affymetrix Arabidopsis Gene
1.0 ST microarray was used to determine gene sequence and expression. Five genes sequences were obtained from the handheld system: AQP2, ABC transporter, Ribulose Bisphosphate Carboxylase-Oxygenase, Alkaline/neutral invertase, and Sterol-14 demethylase. To confirm that AQP2 codes for plasma membrane intrinsic protein 2 (PIP2), gateway cloning followed by a physiological study with stopped-flow spectroscopy was undertaken. Despite sequence divergence between the two species, 24.2% of Arabidopsis Gene 1.0 ST array was hybridized to dwarf mistletoe RNA; this hybridization identified approximately 1,000 genes that are highly differentially expressed in dwarf mistletoe during fruit development. Further investigation of the Affymetrix results revealed several additional mistletoe genes, Stomatal cytokinesis defective2, Movement protein binding protein, Eceriferum1, and SHINE2, that are seasonally up and down regulated (May vs. September) and are likely involved in the explosive seed dispersal process. With these results in hand, research can advance towards molecular insights into not only explosive seed dispersal in dwarf mistletoe, but also into other processes such as development, reproduction, photosynthesis light response, and parasitism-associated gene expression within dwarf mistletoe and
related plants. Ideally, this work will provide new opportunities for investigating novel avenues of plant-plant pest control. |
| Alternative Abstract: |
| Alternative Abstract | Language |
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Weltweit sind Mistelpflanzen wichtige Waldschädlinge, die auf allen Kontinenten neben der Antarktis vorkommen. In Nordamerika ist die Kontrolle des Koniferenparasitismus durch Zwergmisteln, insbesondere Arceuthobium americanum, eine Herausforderung. Zwergmisteln sind zweihäusige parasitäre Blütenpflanzen mit einem einzigartigen und effektiven Samenverbreitungsmechanismus. Aufgrund der großen Wasseransammlung in der Frucht, die sowohl die Fruchtgröße als auch den internen hydrostatischen Druck erhöht, waren der Wassertransport in die Frucht und die mögliche Beteiligung von intrinsischen Proteinen der Plasmamembran (PIPs), insbesondere Aquaporinen (AQPs), r Schwerpunkt der Untersuchung. Vorangegangene Forschungen haben auch gezeigt, dass die Verdickung der Kutikula, die Abnahme der Stomata und die Thermogenese Faktoren bei der Samenentladung sind.
Daher wurden hier molekulare Arbeiten durchgeführt, mit dem Ziel, Gene aufzudecken, die an physiologischen Prozessen beteiligt sind und möglicherweise mit der Sprengung von Saatgut in Zusammenhang stehen sowie die Expression dieser Gene zu untersuchen. Das übergeordnete Ziel dieses Projekts war es daher, Gensequenzierungs- und Expressionsdaten für Arceuthobium spp. zu erhalten sowie Einblick in die Beteiligung von AQPs und anderen Proteinen zu gewinnen, die wahrscheinlich für die Erzeugung von hohem hydrostatischem Druck und den Mechanismus der explosiven Samenabgabe verantwortlich sind. Viele Methoden wurden angewandt, um die RNA aus der Frucht zu extrahieren, einschließlich traditioneller als auch neuer kommerziell erhältlicher Methoden. Nach erfolgreicher Extraktion wurde eine cDNA-Bibliothek aufgebaut. Eine nichtstandardisierte heterologe Microarray-Hybridisierung, die unkonventionell für die Transkriptionsanalyse von Nichtmodellspezies verwendet wurde. Angewendet wurde sowohl das MicroCASTer-Handheld-System als auch eine Affymetrix-Arabidopsis-GenChip Analyse. Aus dem Handheld-System wurden fünf Gensequenzen erhalten: AQP2, ABC-Transporter, Ribulose-Bisphosphat-Carboxylase-Oxygenase, Alkaline / Neutral-Invertase und Sterol-14-Demethylase. Um zu bestätigen, dass AQP2 für das Plasmamembran-Intrinsic-Protein 2 (PIP2) kodiert, wurde die Gateway-Klonierung gefolgt von einer physiologischen Studie mit gestoppter Flussspektroskopie durchgeführt. Trotz Sequenzdivergenz zwischen den beiden Spezies wurden 24,2% des Arabidopsis Gene 1.0 ST-Arrays an Zwerg-Mistel-RNA hybridisiert. Diese Hybridisierung identifizierte etwa 1.000 Gene, die während der Fruchtentwicklung in Zwergmisteln stark unterschiedlich exprimiert werden. Weitere Untersuchungen der Affymetrix-Ergebnisse ergaben mehrere zusätzliche Mistelgene, wie z.B. Stomatal Cytokinesis defective2, Movement-Protein-Bindungsprotein, Eceriferum1 und SHINE2, die saisonal nach oben und unten reguliert werden (Mai vs. September) und wahrscheinlich am Saatgut-Verbreitungssystem beteiligt sind. Zusammenfassend wurde neue Erkenntnisse gewonnen über den Mechanismus der Samen-Verbreitung in Zwergmistelzweigen, aber auch über andere Prozesse wie Entwicklung, Reproduktion, Photosynthese-Lichtreaktion und Parasitismus-assoziierte Genexpression innerhalb von Zwergmisteln und verwandte Pflanzen. Im Idealfall bietet diese Arbeit neue Möglichkeiten für die Erforschung neuer Wege der Pflanzen-Pflanzen-Schädlingsbekämpfung. | German |
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