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DNA replication dynamics in embryonic stem cells

Weber, Patrick (2018):
DNA replication dynamics in embryonic stem cells.
Darmstadt, Technische Universität,
[Ph.D. Thesis]

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Dissertation Patrick Weber, FB10, November 2018 - Text (PDF)
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: DNA replication dynamics in embryonic stem cells
Language: English
Abstract:

DNA replication is one of the most fundamental processes in every living organism, required for the propagation of a cells (epi)genetic information. To ensure the error-free duplication and transmission of all genetic material exactly once per cell cycle, DNA replication follows a tightly controlled spatio-temporal program which is conserved across many species. Especially in higher eukaryotic organisms, however, the regulation of this program needs to be dynamic and flexible enough, in order to allow the coordination with other DNA-dependent processes like transcription and DNA repair. Furthermore, early studies already showed that the replication timing program undergoes remarkable changes during cellular development that can be controlled on multiple levels. During the early embryonic stages of Drosophila and Xenopus, for example, DNA duplication is achieved in the order of minutes and depends on the availability of maternal factors that allow rapid DNA synthesis in the absence of transcription, a specialized cell cycle organization characterized by the lack of gap phases which allows cells to oscillate between S-phase and cell division, as well as differences in the regulation of origin licensing and activation events. More recently, it was shown that embryonic stem cells of mice and humans are also subject to massive rearrangements in their DNA replication timing program during development that can affect as much as 50 % of the whole genome. In the course of this work, I took a closer look at these developmental differences in embryonic stem cells of the mouse (mESCs) and analyzed how they manifest in situ. With the use of classical nucleotide pulse-chase experiments, I performed a detailed characterization of the DNA replication program of mES cells, which was subsequently confirmed in vivo. I observed remarkable differences in the replication timing of pericentromeric heterochromatin, which may be explained on the basis of differences in chromatin organization of pluripotent cells. With the use of 3-dimensional fluorescence in situ hybridization (3D-FISH), I analyzed the specific replication timing of three major chromosomal tandem repeat elements, i.e. minor and major satellite repeats and telomeres, and identified the Y-chromosome as the last structure to be replicated during S-phase in male cells. I could further show that its duplication occurs in a synchronous manner, similar to that of the inactive X-chromosome of female cells, which suggests a distinct mode of replication that may be specific to these two inactive chromosomes. Using a combination of single molecule and super-resolution microscopy techniques I was able to characterize important molecular parameters of the embryonic stem cell replicon, which allowed me to compare the conservation of this crucial functional unit of DNA replication, with that of somatic cells published in a recent study. These data could indicate further developmental differences in the organization of DNA replication, based on mechanisms that might be conserved between mammalian species, frogs and even flies. Last but not least, I analyzed the effect of the loss of DNA methylation on DNA replication. While the lack of this important base modification did not interfere with the global progression of the DNA replication machinery, the results show that DNA methylation could be important for the control of DNA helix stability and might have the ability to modulate DNA-dependent metabolic processes on the molecular level.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die DNA-Replikation ist einer der fundamentalsten Prozesse in jedem lebenden Organismus, der für die Übertragung der (epi)genetischen Information einer Zelle notwendig ist. Um die fehlerfreie Vervielfältigung und Weitergabe des gesamten genetischen Materials genau einmal pro Zellzyklus zu gewährleisten, folgt die DNAReplikation einem streng kontrollierten räumlich-zeitlichen Programm, welches über viele Arten hinweg identisch ist. Insbesondere in höheren eukaryotischen Organismen muss die Regulation dieses Programms jedoch dynamisch und flexibel genug sein, um die Koordination mit anderen DNA-abhängigen Prozessen wie Transkription und DNAReparatur zu ermöglichen. Darüber hinaus zeigten bereits frühe Studien, dass dieses replication timing program bemerkenswerte Änderungen während der zellulären Entwicklung durchläuft, welche auf mehreren Ebenen kontrolliert werden können. So findet die DNA Vervielfältigung während der frühen embryonalen Stadien von Drosophila und Xenopus beispielsweise innerhalb weniger Minuten statt und ist abhängig von der Verfügbarkeit maternaler Faktoren, welche eine schnelle DNA-Synthese in Abwesenheit von Transkription erlauben, sowie einer spezialisierten Organisation des Zellzyklus - gekennzeichnet durch das Fehlen von gap Phasen, was den Zellen ermöglicht zwischen SPhase und Zellteilung zu wechseln - und Unterschieden in der Regulierung des licensings und der Aktivierung von Replikationsursprüngen. Vor einiger Zeit wurde zudem gezeigt, dass embryonale Stammzellen von Mäusen und Menschen ebenfalls einer massiven Umorganisation ihres DNA replication timing programs während ihrer Entwicklung unterliegen, welche bis zu 50% des gesamten Genoms betreffen können. Im Zuge dieser Arbeit habe ich diese Entwicklungsunterschiede in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) genauer untersucht und analysiert, wie sich diese in situ manifestieren. Unter Verwendung klassischer nucleotide pulse-chase Experimente führte ich eine detaillierte Charakterisierung des DNA-Replikationsprogramms von mES-Zellen durch, welches anschließend in vivo bestätigt werden konnte. Ich beobachtete bemerkenswerte Unterschiede im Zeitpunkt der Replikation von perizentromerischem Heterochromatin, was auf der Basis von Unterschieden in der Chromatinorganisation in pluripotenten Zellen erklärt werden könnte. Mithilfe von 3D Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (3D-FISH) analysierte ich die Zeitpunkte der Replikation dreier wichtiger chromosomaler Tandem-Repeat-Elemente - minor und major satellite repeats und Telomere. Außerdem identifizierte ich das Y-Chromosom als diejenige Struktur, welche zuletzt während der S-Phase in männlichen Zellen repliziert wird. Ich konnte ferner zeigen, dass seine Duplikation in ähnlicher Weise synchron verläuft wie die des inaktiven X-Chromosoms weiblicher Zellen, was auf eine spezielle Art der Replikation hindeutet, welche für diese zwei inaktiven Chromosome spezifisch sein könnte. Mit einer Kombination von Einzelmolekül- und hochauflösenden Mikroskopietechniken konnte ich wichtige molekulare Parameter des Stammzellreplikons charakterisieren, was es mir ermöglichte, diese wichtige funktionale Einheit der DNA-Replikation mit der von somatischen Zellen zu vergleichen, welche in einer aktuellen Studie publiziert wurden. Diese Daten könnten auf weitere Entwicklungsunterschiede bei der Organisation der DNAReplikation basierend auf Mechanismen hinweisen, welche zwischen Säugetierarten, Fröschen und sogar Fliegen konserviert sein könnten. Abschließend habe ich die Auswirkung des Verlusts von DNA-Methylierung auf die DNAReplikation untersucht. Während das Fehlen dieser wichtigen Basenmodifikation den generellen Verlauf der DNA-Replikationsmaschinerie nicht beeinträchtigte, zeigten die Ergebnisse, dass die DNA-Methylierung eine Rolle in der Kontrolle der DNA-Helix-Stabilität spielen könnte, um so DNA-abhängige Stoffwechselprozesse auf molekularer Ebene zu beeinflussen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 21 Nov 2018 14:53
Last Modified: 09 Jul 2020 02:24
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-81890
Referees: Cardoso, Prof. Dr. M Cristina and Laube, Prof. Dr. Bodo
Refereed: 9 November 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8189
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