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Bedeutung von Interleukin-10 für die Funktionalität von NK-Zellen und ihre Wechselwirkung mit umgebenden Immunzellen

Waldmann, Anja (2018):
Bedeutung von Interleukin-10 für die Funktionalität von NK-Zellen und ihre Wechselwirkung mit umgebenden Immunzellen.
Darmstadt, Technische Universität,
[Ph.D. Thesis]

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AnjaWaldmann Dissertation 2018.pdf - Submitted Version
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Bedeutung von Interleukin-10 für die Funktionalität von NK-Zellen und ihre Wechselwirkung mit umgebenden Immunzellen
Language: German
Abstract:

Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) repräsentieren einen wichtigen Effektorzelltyp in der adoptiven Krebs-Immuntherapie, da sie imstande sind, maligne Zellen direkt zu eliminieren und die Tumor-spezifische adaptive Immunantwort zu regulieren. Als allogenes Zell-therapeutikum kommt in experimentellen Ansätzen neben primären Spender-NK-Zellen auch die humane NK-Zelllinie NK-92 zum Einsatz. NK-92 Zellen können in vitro unter GMP-Bedingungen gut expandiert und genetisch modifiziert werden. Da die natürliche Zytotoxizität dieser Zellen gegenüber Krebszellen von soliden Tumoren begrenzt ist, wurden NK-92 Zellen mit chimären Antigenrezeptoren (CARs) ausgestattet, wodurch sie definierte Antigene auf der Oberfläche von Tumorzellen erkennen und Antigen-positive Zellen effizient abtöten können. Eine in dieser Arbeitsgruppe generierte CAR NK-92 Zelllinie ist NK-92/5.28.z, welche gegen das Tumor-assoziierte Antigen ErbB2 gerichtet ist und in präklinischen Tierexperimenten zur Abstoßung ErbB2-exprimierender Tumoren führte. Außerdem induzierte die Behandlung mit NK-92/5.28.z Zellen in immunkompetenten Mäusen einen immunologischen Langzeitschutz gegen das Auswachsen erneut injizierter Tumorzellen. Eine mögliche Erklärung dafür ist die Beeinflussung der Aktivität von endogenen Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung durch die Sekretion pro-inflammatorischer Zytokine durch aktivierte NK-Zellen. In vitro Experimente haben gezeigt, dass CAR NK-92 Zellen nach Kontakt mit Antigen-positiven Tumorzellen große Mengen pro-inflammatorischer Zytokine wie IFN-γ sekretieren. Interessanterweise sezernieren aktivierte CAR NK-92 Zellen jedoch auch das immunregulatorische Zytokin Interleukin (IL)-10. Hierbei handelt es sich um ein Zytokin mit pleiotropen Effekten, das von diversen Immunzellen ausgeschüttet wird. Grundsätzlich kann IL-10 pro-inflammatorischen Zytokinen entgegenwirken und die endogene Anti-Tumor-Antwort dämpfen. Allerdings ist IL 10 auch in der Lage, die Zytotoxizität von T-Zellen und NK-Zellen zu steigern. So ist in der derzeitigen Literatur die Bedeutung des von NK-Zellen sekretierten IL-10 für NK-Zellen selbst und für umgebende Immunzellen nicht eindeutig geklärt. Daher war das Ziel dieser Arbeit, den Einfluss von IL-10 auf das Wachstum und die Funktion von NK-Zellen und auf deren Interaktion mit anderen Immunzellen besser zu verstehen. Im Fokus der Untersuchungen standen die kontinuierlich expandierbare NK-Zelllinie NK-92 sowie die davon abgeleitete CAR-Effektorzelllinie NK-92/5.28.z als klinisch relevante Modelle für die adoptive Immuntherapie. Nach Aktivierung von parentalen und ErbB2-spezifischen NK-92 Zellen zeigte sich eine erhöhte IL-10 Expression auf mRNA- und Protein-Ebene, was frühere Ergebnisse der Arbeitsgruppe bestätigte. Zudem wurde die Expression des Rezeptors IL-10Rα auf NK-92 Zellen und CAR NK-92/5.28.z Zellen nachgewiesen, sodass endogen produziertes IL-10 autokrin auf die Zellen zurückwirken kann. Im Folgenden wurden Ansätze zur Hemmung der Produktion und biologischen Aktivität des von NK-92 Zellen sekretierten IL-10 untersucht. So wurde ein rekombinanter anti-IL-10 Mini-Antikörper mit vier Bindestellen generiert, der die Aktivität von löslichem IL-10 neutralisierte. Zudem wurden Ansätze erprobt, die die IL-10 Expression oder Sekretion in NK-92 Zellen unterbinden. Dazu zählten die shRNA-vermittelte Herunterregulation der IL-10 Expression auf mRNA-Ebene, ein CRISPR/Cas9-vermittelter IL 10 Gen-knockout auf DNA-Ebene und schlussendlich eine Hemmung der IL-10 Sekretion auf Protein-Ebene mittels intrazellulär exprimierter anti-IL-10 scFv-Antikörper (Intrabodies). Hierzu wurden scFv-Antikörpermoleküle konstruiert, die in den extrazellulären Raum sekretiert werden (αIL-10S), auf der Zelloberfläche lokalisiert sind (αIL-10TM) oder durch eine zusätzliche KDEL-Sequenz am C-Terminus im Lumen des endoplasmatischen Retikulums zurückgehalten werden, um dadurch die Sekretion von IL-10 zu unterdrücken (αIL-10ER). Die untersuchten Strategien zeigten sich alle in NK-92 Zellen funktional, führten jedoch zu einer im Ausmaß unterschiedlichen Reduktion der IL-10 Expression. In Bezug auf die Reduktion der IL-10 Sekretion erwiesen sich insbesondere die Gen-Editierung mit CRISPR/Cas9 und die Expression von αIL-10ER Intrabodies als gleichermaßen hoch effektiv. Es zeigte sich, dass eine reduzierte IL-10 Expression oder Sekretion die Proliferation, die natürliche und CAR-vermittelte spezifische Zytotoxizität der NK-Zellen und die Sekretion der pro-inflammatorischen Zytokine IFN-γ und MIP-1α nicht beeinflusste. Ein für die Funktionalität von NK-92 Zellen entscheidender Beitrag von endogen produziertem IL-10 kann daher ausgeschlossen werden. Allerdings bewirkte die Verminderung oder vollständige Eliminierung der IL-10 Expression in NK-92/5.28.z Zellen je nach gewähltem Ansatz eine unterschiedliche Erhöhung der TNF-α Sekretion. Um zu untersuchen, ob das von aktivierten CAR NK-92 Zellen sezernierte IL-10 einen Einfluss auf den Phänotyp umgebender Antigen-präsentierender Zellen hat, wurden Transwell-Experimente mit Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen und Makrophagen durchgeführt. Die löslichen Faktoren aktivierter NK-92/5.28.z Zellen leiteten dabei die Reifung dendritischer Zellen ein, wobei dieser Prozess durch eine IL-10 Depletion in CAR NK-92 Zellen weiter gefördert wurde. Ohne Beeinflussung der IL-10 Produktion induzierten die sekretierten Botenstoffe aktivierter NK-92/5.28.z Zellen die Polarisierung von Makrophagen hin zu einem M2-Phänotyp, welcher in der Tumorprogression involviert ist. Wurde die Aktivität des von aktivierten NK-92/5.28.z Zellen sekretierten IL-10 dagegen neutralisiert oder seine Sekretion unterbunden, begünstigte dies die Ausprägung eines M1-ähnlichen Phänotyps. Diese Makrophagen-Population weist in der Regel antitumorale Eigenschaften auf. Entsprechend könnten diese Effekte die therapeutische Wirkung IL-10-depletierter NK-92/5.28.z Zellen in vivo durch eine verbesserte Aktivierung endogener Immunzellen steigern. Um die Anti-Tumor-Aktivität IL-10-depletierter NK-92/5.28.z Zellen in vivo zu untersuchen, wurde ein immun-kompetentes Mausmodell mit ErbB2-überexprimierenden B16-F10 Melanomzellen in C57BL/6N Albino Mäusen etabliert. Die Behandlung subkutan verabreichter B16-F10/ErbB2 Tumorzellen mit unmodifizierten oder IL-10-depletierten NK-92/5.28.z Zellen verlängerte dabei das Überleben der Mäuse im Vergleich zu Kontroll-Tieren, die mit parentalen NK-92 Zellen oder Puffer behandelt wurden. Allerdings wurde keine Langzeit-Regression der Tumoren der behandelten Tiere durch die Injektion von CAR NK-92 Zellen erzielt. Zudem waren die Überlebenskurven der mit unmodifizierten oder IL-10-depletierten NK-92/5.28.z Zellen therapierten Behandlungsgruppen nicht signifikant verschieden. Eine mögliche Erklärung für den fehlenden Langzeiteffekt der Behandlung könnte sein, dass B16-F10/ErbB2 Zellen nur sehr geringe Mengen an MHC-Klasse I exprimieren und damit einem Angriff zytotoxischer CD8+ T-Zellen entgehen können. Wie in einem unabhängigen in vitro Versuch gezeigt wurde, induziert zwar murines IFN-γ, nicht aber das von NK-92 Zellen sezernierte humane IFN-γ die Expression von MHC-Klasse I auf B16-F10/ErbB2 Zellen. Entsprechend ist davon auszugehen, dass das humane IFN-γ auch in vivo keinen Einfluss auf die murinen Tumor- und Immunzellen ausübt. So könnte aufgrund der fehlenden Aktivität des ausgeschütteten humanen IFN-γ die Hemmung der IL-10 Sekretion in NK-92/5.28.z Zellen keinen entscheidenden Beitrag zur Induktion einer anhaltenden endogenen Anti-Tumor-Immunantwort leisten. Die im Tiermodell erhaltenen Daten verdeutlichen jedoch, dass die Hemmung der IL-10 Sekretion in NK-92/5.28.z Zellen zumindest keinen negativen Einfluss auf den Therapieerfolg hatte. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Hemmung der IL-10 Expression in NK-92 Zellen oder die Neutralisierung der IL-10 Aktivität die wesentlichen Funktionen dieser NK-Zellen nicht beeinträchtigt, aber den Phänotyp umgebender Immunzellen in Richtung einer verbesserten antitumoralen Aktivität beeinflussen kann. Ob dies auch eine Steigerung der Anti-Tumor-Immunantwort im Kontext eines lebenden Organismus bedingt, muss in weiterführenden in vivo Studien untersucht werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Natural killer (NK) cells play a critical role in antitumor immunity by directly eliminating malignant cells and by regulating tumor-specific adaptive immune responses. In addition to donor-derived primary NK cells, the continuously growing cytotoxic NK cell line NK-92 is being developed as an allogeneic cell therapeutic for adoptive cancer immunotherapy. NK-92 cells can be expanded and genetically modified under Good Manufacturing Practice (GMP)-compliant conditions and have already entered clinical trials. To enhance their antitumor activity, NK-92 cells have been genetically engineered to express chimeric antigen receptors (CARs) that facilitate selective recognition and elimination of tumor cells. Our group previously generated the genetically modified NK-92 cell clone NK-92/5.28.z that expresses a CAR specific for the tumor-associated surface antigen ErbB2 (HER2). In immunocompetent mouse tumor models, treatment with these cells resulted in the cure of syngeneic ErbB2-positive tumors and long-term protection against rechallenge at distant sites, indicating the induction of adaptive antitumor immunity. In vitro co-culture of NK-92/5.28.z with ErbB2-positive targets induced secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFN-γ by the NK cells, which may influence endogenous bystander immune cells in the tumor microenvironment. In addition, activated CAR NK-92 cells secrete significant levels of immunoregulatory interleukin (IL)-10. IL-10 expression is found in many different types of immune cells. This cytokine is typically regarded as an anti-inflammatory, immunosuppressive molecule, but may also possess immunostimulatory properties. It is generally accepted that IL-10 can counteract pro-inflammatory factors and dampen tumor-suppressive activities of bystander immune cells in the tumor microenvironment. Conversely, it has been shown that IL-10 stimulates the cytotoxicity of T cells and NK cells. Hence, the role of NK cell-derived IL-10 for the NK cells themselves and bystander immune cells is not fully understood. Using the continuously expanding NK cell line NK-92 and the CAR-engineered NK-92 variant NK-92/5.28.z as clinically relevant models for adoptive immunotherapy, the aim of this thesis was to investigate the influence of IL-10 on proliferation and functionality of the NK cells, and to better understand its role in the interaction of the NK cells with bystander immune cells. Activation of parental and ErbB2-specific NK-92 cells induced IL-10 mRNA and protein expression, which confirmed results previously generated in this group. Additionally, expression of the IL-10 receptor IL-10Rα was found in NK-92 and CAR NK-92/5.28 cells, indicating the possibility of autocrine stimulation by endogenously produced IL-10. Subsequently, different strategies for targeted interference with IL-10 expression and activity were evaluated. These included the generation of a novel recombinant anti-IL-10 mini-antibody with four IL-10 binding sites, which displayed antagonistic activity and inhibited binding of IL-10 to its receptor. Furthermore, marked reduction of IL-10 expression and secretion was achieved upon genetic modification of NK-92 cells with an IL-10 mRNA-specific shRNA construct, specific editing of the IL-10 gene using the CRISPR/Cas9 system or transduction with lentiviral vectors for intracellular expression of anti-IL-10 scFv antibodies (intrabodies). In the latter approach, recombinant anti-IL-10 antibodies for direct expression in NK-92 cells were designed to either block IL-10 activity in the extracellular space (αIL-10S), prevent secretion of endogenously synthesized IL-10 by inhibiting its transport to the cell surface (αIL-10ER), or trap IL-10 on the cell surface (αIL-10TM). Thereby gene editing by CRISPR/Cas9 and intracellular expression of the endoplasmic reticulum (ER)-retained αIL-10ER antibody reduced basic and activation-induced IL-10 expression most efficiently and to a similar extent. IL-10 depleted parental and ErbB2-specific NK-92 cells displayed growth properties and natural and CAR-mediated cytotoxicity indistinguishable from unmodified NK-92 cells. Furthermore, secretion of pro-inflammatory cytokines IFN-γ and MIP-1α was not affected by downregulation of IL-10 in NK-92 cells. Taken together, these data demonstrate that endogenously produced IL-10 does not influence those functions in NK-92 cells. However, depending on the strategy employed for downmodulation of IL-10, enhanced activation-induced secretion of pro-inflammatory TNF-α was observed. To assess whether IL-10 production by CAR NK-92 cells and its downmodulation affects the phenotype of bystander antigen-presenting cells, transwell co-culture assay experiments with monocyte-derived dendritic cells and macrophages were conducted. Thereby, downregulation of IL-10 production in activated CAR NK-92 cells enhanced polarization of bystander macrophages towards a tumor-suppressive M1-like phenotype and supported maturation of dendritic cells in vitro. Hence, IL-10 depletion in NK-92/5.28.z cells may enhance the therapeutic efficacy of adoptive cell therapy in vivo. To investigate antitumor activity of unmodified and IL-10-depleted NK-92/5.28.z cells in vivo, an immunocompetent model with human ErbB2 expressing murine B16-F10 melanoma cells in syngeneic C57BL/6N mice was established. Animals bearing ErbB2-positive tumors were treated with NK-92/5.28.z or NK-92/5.28.z cells expressing αIL-10ER, which both prolonged survival of the mice to a similar extent in comparison to mice treated with parental NK-92 cells or PBS. However, no cures or long-term tumor regression was observed. One reason for the inability of NK-92/5.28.z cells to induce measurable endogenous antitumor immunity in this system and the absence of an added benefit of IL-10 depletion could be the low expression of MHC-I molecules on the surface of B16-F10/ErbB2 cells, which may allow them to escape recognition and destruction by cytotoxic CD8+ T cells. It is well known that exposure of human and murine tumor cells to IFN-γ can increase MHC-I expression, making them more susceptible to recognition by the endogenous immune system. However, the effects of human IFN-γ, which is released at high levels by activated CAR NK-92 cells, towards murine cells are limited due to the species-specific interaction of IFN-γ with IFNGR1. This was confirmed in an in vitro assay, demonstrating that murine IFN-γ readily upregulated MHC-I expression in B16-F10/ErbB2 cells, while human IFN-γ failed to do so. Thus, inhibition of IL-10 secretion by activated NK-92/5.28.z cells may not have increased the antitumor activity of NK-92/5.28.z cells due to the lack of a corresponding stimulatory effect of human IFN-γ in the murine system. Nevertheless, the observed transient inhibition or tumor growth by both, unmodified and IL-10-depleted NK-92/5.28.z cells showed that prevention of IL-10 secretion in NK-92/5.28.z cells did not affect direct antitumor activity of the cells or influence therapeutic efficacy in a negative fashion. Taken together, the data presented in this thesis demonstrate that inhibition of IL-10 expression in NK-92 cells or antibody-mediated neutralization of its activity is feasible without affecting overall functionality of the NK cells. Importantly, in in vitro models IL-10 depletion enhanced the stimulatory effects of NK-92 and CAR NK-92 cells on bystander immune cells, supporting the maturation of dendritic cells and polarization of macrophages towards a tumor-suppressive phenotype. Further in vivo studies will be necessary to analyze in more detail the potential influence of IL-10 depletion on the therapeutic efficacy of adoptive cell therapy with CAR-engineered NK cells.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Cell Biology and Epigenetics
Date Deposited: 10 Jan 2019 08:53
Last Modified: 09 Jul 2020 02:24
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-81823
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Laube, Prof. Dr. Bodo
Refereed: 21 September 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/8182
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