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CD8 Receptor-Targeted Lentiviral Vectors – an Approach for the in vivo Generation of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells

Pfeiffer, Anett (2018):
CD8 Receptor-Targeted Lentiviral Vectors – an Approach for the in vivo Generation of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells.
Darmstadt, Technische Universität, [Ph.D. Thesis]

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: CD8 Receptor-Targeted Lentiviral Vectors – an Approach for the in vivo Generation of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells
Language: English
Abstract:

Gene therapeutic applications have gained substantial significance in modern medicine, especially for the treatment of cancer diseases. Genetically engineered T cells that express a chimeric antigen receptor (CAR) have been shown to mediate impressive anti tumoral efficacy in patients suffering from B cell malignancies. In 2017, the first CAR T cell product was approved in the United States (U.S.). However, cell selective gene delivery still represents a big hurdle, making ex vivo gene delivery indispensable that is accompanied by complex efforts and high costs due to the personalized treatment. Receptor-targeted lentiviral vectors mediate selective gene delivery into a certain cell type and represent a powerful tool for the in vivo gene transfer. This thesis investigates the in vivo generation of CAR T cells in small animal models using a CD8-targeted lentiviral vector (CD8-LV). CD8-LV has been generated before by pseudotyping lentiviral vectors with modified Nipah virus glycoproteins displaying an anti-human CD8-targeting domain. In this thesis, selective in vivo reporter gene delivery into CD8+ lymphocytes was demonstrated upon systemic administration of CD8-LV into mice engrafted with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC). Thereby, reporter gene expression exclusively within the CD8+ cells proved the highly selective targeting of CD8-LV. In vitro generation of CAR T cells upon transduction of PBMC with CD8-LV transferring a CD19 specific chimeric antigen receptor was shown, and functionality of these generated CAR T cells was demonstrated. They selectively expanded upon antigen stimulus and specifically killed CD19+ target tumor cells in vitro. CD8-LV(CAR) administration into mice resulted in the in vivo generation of CAR T cells with remarkably high frequencies of CAR positive cells. Higher frequencies of transgene-positive and CD8-positive cells compared to reporter gene transfer indicated selective CAR T cell expansion in vivo. Importantly, functionality of in vivo generated CAR T cells was demonstrated when CD19+ target cells had been eliminated. Moreover, CD19+ cells were identified as antigen stimulus triggering antigen-specific CAR T cell proliferation. Phenotype analysis of CAR T cells by surface marker analysis revealed the presence of diversely differentiated CAR T cells, which is highly preferable in terms of generating a pool of CAR T cells with various effector functions and proliferative capabilities. Furthermore, anti-tumoral efficacy was evaluated in xenograft mice engrafted with human tumor cells. Although tumor outgrowth was not prevented, these CAR T cells demonstrated killing activities against CD19+ B cells and emigrated to various organs. Showing organ-specific subset distribution of diversely differentiated CAR T cells, highest levels of effector CAR T cells were observed at the tumor site. This thesis highlights the potential of CD8-LV to genetically engineer CD8 T cells in vivo. Selective gene transfer and functionality of in vivo generated human CAR T cells represent encouraging data to build on for further investigations in translational research. Pursuing receptor-targeted LVs for clinical application as an alternative approach of CAR T cell generation opens up an attractive possibility to tremendously simplifying CAR T cell therapy. In conclusion, CD8-LV represents a promising tool for the in vivo CAR T cell generation with the potential to transform personalized CAR T cell therapy into a broad applicable treatment option.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Gentherapeutische Anwendungen gewinnen zunehmend an Bedeutung in der modernen Medizin, im Besonderen auch in der Krebstherapie. Genetisch veränderte T-Zellen, die einen chimären Antigen-Rezeptor (CAR) exprimieren, haben beeindruckende anti tumorale Wirksamkeit in Patienten gezeigt, die an B-Zell Erkrankungen litten. Dies führte 2017 zur Marktzulassung der ersten CAR-T-Zell Therapie in den Vereinigten Staaten von Amerika. Eine der größten Herausforderungen der Gentherapie bleibt jedoch der zielgerichtete Gentransfer, sodass eine ex vivo Manipulation der Zellen noch immer unerlässlich ist. Diese personalisierte Behandlung ist mit hohem Aufwand und Kosten verbunden. Rezeptor targetierte Vektoren vermitteln selektiven Gentransfer in einen bestimmten Zelltyp und könnten einen alternativen Ansatz zur derzeitigen Behandlung eröffnen. Diese Arbeit zeigt die in vivo Generierung von CAR-T-Zellen in Kleintiermodellen mittels eines CD8-targetierten lentiviralen Vektors (CD8-LV). Der CD8-LV wurde bereits zuvor generiert, wobei der lentivirale Vektor mit modifizierten Glykoproteinen des Nipah Virus pseudotypisert und eine Targeting-Domäne gegen den humanen CD8 Rezeptor präsentiert wird. In der vorliegenden Arbeit wurde zuerst der selektive Reportergentransfer in CD8+ Zellen in vivo nachgewiesen. Dazu wurden humane Immunzellen in Mäuse transplantiert und der Vektor systemisch injiziert. Die Expression des Reportergens, ausschließlich in den Zielzellen, wies einen hoch selektiven Gentransfer nach. In vitro Studien zeigten die Generierung von CAR-T-Zellen mittels CD8-LV, der einen CD19-spezifischen CAR in CD8 T-Zellen transferierte. Des Weiteren wurden die Funktionalität der CAR-T-Zellen gezeigt, wie zum Beispiel die selektive Expansion nach Antigen-Stimulus und die spezifische Eliminierung von CD19+ Tumorzellen. Nach Injektion von CD8-LV(CAR) konnte die in vivo Generierung von CAR-T-Zellen nachgewiesen werden, wobei ein bemerkenswert hoher Anteil der CD8 T-Zellen CAR-positive Zellen waren. Dabei war der prozentuale Anteil von transgen exprimierenden Zellen sowie von CD8-positiven Zellen im Vergleich zum Reportergentransfer erhöht, was darauf hindeutete, dass eine selektive Expansion der CAR-T-Zellen stattgefunden hatte. Diese CAR-T-Zellen eliminierten CD19+ Zellen, was darauf hindeutete, dass in vivo generierte CAR-T-Zellen funktional waren. Die Phänotypisierung anhand von Oberflächenmarkern zeigte die Generierung von CAR-T-Zellen mit unterschiedlichem Differenzierungsgrad. Dies ist gerade in Bezug auf die klinische Wirksamkeit von CAR-T-Zellen erwünscht, da unterschiedlich ausdifferenzierte CAR-T-Zellen einerseits wichtige Effektor Funktionen erfüllen als auch proliferatives Potential besitzen. Die anti-tumorale Wirksamkeit wurde in Mäusen überprüft, die humane Tumorzellen transplantiert bekamen. Obwohl das Tumorwachstum nicht verhindert wurde, eliminierten die CAR-T-Zellen die CD19+ B-Zellen und wanderten in verschiedene Organe aus. Dabei wurde eine Organ-spezifische Verteilung von Subtypen beobachtet, wobei der größte Anteil der Effektor CAR-T-Zellen beim Tumor gefunden wurde. Diese Arbeit zeigt das Potential von CD8-LV CD8 T-Zellen in vivo genetisch zu verändern. Selektiver Gentransfer und funktionale in vivo modifizierte Zellen stellen vielversprechende Daten dar, auf denen in der translationalen Forschung weiter aufgebaut werden kann. Der Ansatz Rezeptor-targetierte lentivirale Vektoren in der klinischen Anwendung zu nutzen, bietet einen neuen Weg CAR-T-Zellen herzustellen und würde eine attraktive Möglichkeit eröffnen die CAR-T-Zell Therapie wesentlich zu vereinfachen. Der CD8-LV stellt ein sehr vielversprechendes Instrument für die in vivo Herstellung von CAR-T-Zellen dar und birgt das Potential die personalisierte CAR-T-Zell Therapie zu revolutionieren und eine breit anwendbare Therapiemöglichkeit zu schaffen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 06 Sep 2018 14:43
Last Modified: 09 Jul 2020 02:13
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-77188
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Löwer, Prof. Dr. Alexander and Buchholz, Prof. Dr. Christian J.
Refereed: 10 August 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7718
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