TU Darmstadt / ULB / TUprints

Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin auf die Funktionalität von inhibitorischen Rezeptoren

Baltzer, Jan :
Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin auf die Funktionalität von inhibitorischen Rezeptoren.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

[img]
Preview
Text
Dr. Arbeit_JAB_07Jun2018_Final.pdf
Available under CC-BY-SA 4.0 International - Creative Commons, Attribution Share-alike.

Download (3MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin auf die Funktionalität von inhibitorischen Rezeptoren
Language: German
Abstract:

Der Glyzin - Rezeptor (GlyR) und der GABAA – Rezeptor (GABAAR) sind ligandengesteuerte inhibitorische Chloridkanäle, welche durch die Aminosäuren Glyzin und GABA aktiviert werden. Als Mitglieder der nikotinischen Azetylcholinrezeptor-Familie (nAChR) besitzen der GlyR und der GABAAR einen pentameren Aufbau. Beim GlyR sind vier α-Untereinheiten (α1-α4 UE) und eine β-UE bekannt die jeweils aus einer extrazellulären N-terminalen Domäne, 4 Transmembrandomänen und einer großen intrazellulären Schleife bestehen. Die GABAARs können sich aus einer Vielzahl von 21 UEs α(1-6), β(1-3), γ(1-3), δ, ε, π, θ, ρ(1-3) zusammensetzen. Eine hohe lokale Konzentration von GlyRs und GABAARs an inhibitorischen Synapsen ist entscheidend für eine effiziente glyzin-/GABAerge Signal-Transmission im Nervensystem und wird durch die Interaktion mit dem Verankerungprotein Gepyhrin gewährleistet. Aufgrund der Dimerisierungs – und Trimerisierungseigenschaften der Gephyrin - Domänen wird angenommen, dass sich unterhalb der postsynaptischen Membran eine hexagonale Matrix ausbildet. In der hexagonalen Matrix entstehen hochaffine Bindestellen für die ß-UE des GlyR und die β-UEs und α-UEs des GABAAR. Die Gephyrin – Bindemotive (gbm) sind in der intrazellulären Schleife (TM3-TM4) der Untereinheiten zu finden. Bei der Akkumulierung von Gephyrin unterhalb der postsynaptischen Membran nimmt der Gehirn-spezifische GDP/GTP Austausch Faktor Collybistin (Cb) eine tragende Rolle ein. So wird angenommen das Cb über die Interaktion der Pleckstrin-homologen Domäne (PH) mit membranständigen PI3P Gephyrin-CbII Komplexe zur postsynaptischen Membran rekrutiert. Ebenfalls eine wichtige Funktion bei der Rekrutierung des Geph-Cb - Komplexes zur Membran nimmt die src homologe 3 (SH3) – Domäne ein. Die SH3 – Domäne agiert als auto – inhibitorische Domäne und belässt Cb in einer inaktiven Konformation. Die Neuroligine (NL) 2 und 4 können mit der SH3 – Domäne des Cb wechselwirken und Cb in eine aktive Konformation überführen. GlyRs welche aufgrund Ihrer fehlenden Wechselwirkung mit dem postsynaptischen Gephyrin-Collybistin-Komplex nicht interagieren können sind extrasynaptisch in der Zellmembran lokalisiert. Die Untersuchungen mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (engl. TEVC) nach heterologer Expression in den Oozyten des afrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis ergaben, dass die intrazellulär lokalisierten Proteine Gephyrin und Collybistin II SH3-, die apparente Glyzin – Affinität des heteropentameren GlyR α1β und des homopentameren GlyR α1-gbm um das 1,5 bis 10-fache verringern, jedoch keine apparente – Glyzin - Affinitätsveränderung beim homooligomeren GlyR α1-wt bewirken. Nach dem Ausschalten der membranwechselwirkenden PH – Domäne von Collybistin II SH3- durch Punktmutationen in der PH – Domäne (RR363-364-NN) ist keine Verringerung der apparenten Glyzin - Affinität mehr zu beobachten. Neuroligin 2 verringert die apparente Glyzin-Affinität des GlyR α1-gbm nach Ko – Expression mit Gephyrin und der inaktiven Collybistin II SH3+ Variante. Gephyrin und Collybistin II SH3- verringern die apparente GABA – Affinität bei GABAAR α1β3 und GABAAR α2β3. Bei GABAAR α2β3 ist dieser Effekt auch auch ohne die Ko – Expression mit Gephyrin zu beobachten. Es konnte ebenfalls gezeigt werden, dass Gephyrin und Collybistin II SH3- die apparente Glyzin – und Glutamat – Affinität des exzitatorisch fungierenden N-Methyl-D-Aspartat Rezeptors (NMDA), nach der Einklonierung des Gephyrin – Bindemotivs in die NR1 – Untereinheit, verringern. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Interaktion von Gephyrin und Collybistin II SH3- mit GlyR α1-gbm zu einer drastischen Reduktion des partiellen Agonisten Taurin vermittelten maximal induzierbaren Stroms führt. Die Oligomisierungsdomänen von Gephyrin beeinflussen die Verringerung der apparenten Glyzin - Affinität des GlyR α1-gbm.

Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Auswirkungen der Gerüstproteine Gephyrin und Collybistin durch eine funktionelle Analyse von ionotropen Rezeptoren mittels TEVC charakterisiert werden können. Somit konnte das Ziel der Etablierung einer zur Validierung geeigneten Methode für die Untersuchung von Rezeptoren mit intrazellulären Proteinen erreicht werden. Diese Untersuchungsmethode könnte in Zukunft dabei helfen die Auswirkungen von krankheitsassoziierten Mutationen in Rezeptor – interagierenden Proteinen auf die Rezeptor Funktionalität zu beschreiben.

.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The Glycine receptor (GlyR) and GABAAA receptor (GABAAR)are inhibitory ligand gated ion channels which can be activated by glycine and GABA. GlyRs and GABAARs are members of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) family and have a pentameric composition. Four α-subunits and one β-subunit are known for GlyRs and each subunit consists of an extracellular loop, 4 transmembrane domains and one large intracellular loop. Twenty-one subunits α(1-6), β(1-3), γ(1-3), δ, ε, π, θ, ρ(1-3) are known for GABAARs which leads to a huge amount of possible receptor compositions. A high local concentration of GlyRs and GABAARs at inhibitory synapses is essential for an efficient glycine-/GABA mediated signal transmission in the central nervous system and this can be ensured through interaction with the scaffolding protein Gephyrin. Gephyrin domains can form dimers and trimers and it is hypothesized that these abilities results in a hexagonal matrix beneath the postsynaptic membrane. High affinity binding positions occur for ß –subunit of GlyRs and β-subunits and α-subunits of GABAARs in the hexagonal matrix. Gephyrin binding motivs (gbm) are located in the intracellular loop (TM3-TM4) of each subunit. The guanine-nucleotide exchange factor Collybistin (Cb) is essential for Gephyrin recruitment beneath the postsynaptic membrane. It is hypothesized that the pleckstrin homologe domain (PH) of Cb interacts with PI3P and recruits Gephyrin-CbII complexes to the postsynaptic membrane. The src homologe domain (SH3) of Cb acts as an auto-inhibitory domain and leave Cb in an inactive conformation. Neuroligins (NL) 2 and 4 can interact with the SH3 domain of Cb and convert Cb in an active conformation. GlyRs which have not the ability to bind to the Gephyrin-Collybistin complexes are located in extrasynaptic membrane regions. The Experiments conducted by two electrode voltage clamp after heterologe expression in oocytes of the African clawed frog indicated that Gephyrin and Collybistin II SH3- decrease 1,5 up to 10 fold the glycine apparent affinity of heteropentameric GlyR α1β and homopentameric GlyR α1-gbm but no change in apparent glycine affinity on homopentameric GlyR α1-wt was detected. The amino acid replacements (RR363-364NN) in the membrane interacting PH – domain of Collybistin II SH3- shows no decrease of apparent glycine affinity. Neuroligin 2 decrease apparent glycine affinity after co-expression with Gephyrin and inactive Collibistin II SH3+. Gephyrin and Collybistin II SH3- decrease apparent GABA – affinity of GABAAR α1β3 and GABAAR α2β3. This effect is also visible without Gephyrin co-expression at GABAAR α2β3. The Experiments also shows that Gephyrin and Collybistin II SH3- decrease apparent glycine- and glutamate affinity at N-Methyl-D-Aspartate Receptors (NMDA) after insertion of the Gephyrin binding motive in the NR1 – subunit. Furthermore it could be shown that the interaction of Gephyrin and Collybistin II SH3- with GlyR α1-gbm leads to a drastic reduction of the partial agonist Taurin related maximal inducible current. The Oligomerization of Gephyrin – domains affect the decrease of apparent glycine affinity of GlyR α1-gbm. It was shown in this dissertation that effects of the scaffolding proteins Gephyrin and Collybistin on ionotrope receptors could be functionally analysed with TEVC. Therefore a method for validation of the interaction between intracellular proteins and receptors was established. This method could be very helpful in near future to understand and describe the impact of disease-associated mutations in receptor interacting proteins on receptor functionalityEnglish
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Neurosensory Systems
Date Deposited: 11 Jun 2018 07:05
Last Modified: 11 Jun 2018 07:05
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-74699
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo and Bertl, Prof. Dr. Adam
Refereed: 29 January 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7469
Export:

Downloads

Downloads per month over past year

Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year