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Impact of ionising radiation on adult neurogenesis: physiological and cellular effects of low and moderate doses of ionising radiation in neural differentiation distinguished by differentiation phase

Rau, Kerstin :
Impact of ionising radiation on adult neurogenesis: physiological and cellular effects of low and moderate doses of ionising radiation in neural differentiation distinguished by differentiation phase.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2018)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Impact of ionising radiation on adult neurogenesis: physiological and cellular effects of low and moderate doses of ionising radiation in neural differentiation distinguished by differentiation phase
Language: English
Abstract:

Comprehensive follow-up of brain cancer patients and re-evaluation of medical data revealed a frightening correlation between low and moderate doses of ionising irradiation and induced cognitive dysfunctions. The particular radio sensitivity of adult neurogenesis within the adult brain is suggested as the major contributor in the underlying pathogenesis. Adult neurogenesis describes the differentiation of neural stem cells to mature neurons in the adult brain. Neural differentiation can be separated in three main phases, early progenitor phase, fate specification phase and cell maturation phase. The cellular base of neural differentiation provides a restricted stem cell pool, out of self-renewing neural stem cells (NSCs). To investigate the impact of low and moderate doses of ionising radiation (IR) on adult neurogenesis we intended to distinguish the differentiation process in its dynamic subpopulations, represented in the individual differentiation phases. Based on ES-derived NSCs we established and characterised a 2D-model system, reflecting the three differentiation phases, of adult neurogenesis. In the first part of this work we characterised the differentiation of the J1 NSC model system concerning specific marker expression, morphology and functional differentiation markers. The broad characterisation revealed that the J1 model system reflects each of the three differentiation phases, i.e. early progenitor, fate specification and cell maturation in adult neurogenesis on the intra- and intercellular as well as on the functional level in a synchronised, time dependent differentiation. We used the synchronous differentiation of the J1 model system to discriminate the individual differentiation phases by time. In the second part of this work we analysed the individual radio sensitivity of the distinct differentiation phases. Addressing issues concerning radiotherapy bystander and diagnostic doses, we used low to moderate x-ray doses between 0.25 and 2Gy. To estimate the distinct radio sensitivity of NSCs and the three differentiation phases, we measured the reduction in vitality of the separated subpopulations and estimated the individual LD50 of each differentiation phase. NSCs, as well as all three differentiation phases, show an individual radio sensitivity significantly different to the other subpopulations. The proliferative subpopulations, NSCs and early progenitors showed the highest radio sensitivity, whereas the final differentiation phase, cell maturation, showed the lowest. In further analyses we investigated the mechanisms responsible for the IR induced reductions in the individual subpopulations. Within the postmitotic differentiation phases, fate specification and cell maturation, radiation induced apoptosis is the underlying mechanism. In the proliferative subpopulations, the reduction in the number of cells is predominantly mediated by reduced proliferation in NSCs and induced apoptosis in early progenitors. To investigate the effect of IR on individual differentiation phases further, we irradiated the three defined differentiation phases and analysed the characteristic differentiation properties of the particular differentiation phase by functional, morphological and histochemical markers post IR. Early progenitors, the first subpopulation within the neural differentiation, are affected in their proliferation, but the migration of the surviving cells is not affected by low dose IR, neither is the entry into the postmitotic status. In the next step we analysed J1 cells irradiated in the fate specification phase. The fate determination of the surviving cell population showed a reduced percentage of future neurons post ionising radiation compared to unirradiated samples. The terminal differentiation phase revealed a broad modulation in the phase specific characteristic properties induced by low dose radiation, determined in altered neuronal architecture and a lower density of synaptic markers in neuroblasts as well as a reduced density of the voltage-gated potassium channels KV1.1. Regarding the functional level we found a long-lasting stagnation in the excitability of the in cell maturation phase irradiated cultures, reflected by a reduced firing rate, decreased coordination in the activity pattern and a loss in spike synchrony. In the last part of this work we investigated whether the properties of the self-renewing NSCs were also affected by IR. In previous work Dr. Bastian Roth determined that functional characteristics of J1 NSCs are modified post low dose IR, mediated via alterations in K+ channel currents. In continuative experiments we investigated if low dose IR leads to changes in the morphological and immunohistological characteristic within the J1 NSC population. The follow up of the irradiated NSCs revealed a highly significant increase of the differentiation marker doublecortin (DCX) within the self-renewing population. By using K+ channel blockers during radiation, we could inhibit the increase in DCX positive cells post low dose IR. In summary we found radiation induced modulations in the phase specific properties of each subpopulation, represented by NSCs and the three differentiation phases, in the third and fourth part of this work. In conclusion, depending on the differentiation phase, we could identify several specific physiological and cellular effects of low and moderate doses of IR during neural differentiation in a ES-derived neural stem cell line.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Umfassende Folgeuntersuchungen von Hirntumorpatienten und die Aufarbeitung medizinischer Daten ergaben eine erschreckende Korrelation zwischen niedrigen und moderaten Dosen ionisierender Strahlung und induzierten kognitiven Dysfunktionen. Die besondere Radiosensitivität der adulten Neurogenese innerhalb des adulten Gehirns wird als wichtigster Faktor für die zugrundeliegende Pathogenese angesehen. Adulte Neurogenese bezeichnet die Differenzierung von neuralen Stammzellen zu reifen Neuronen im adulten Gehirn. Die neurale Differenzierung lässt sich in drei Hauptphasen unterteilen: die frühe Vorläufer-phase, die Zellschicksalsspezifikations-phase und die Zellreifungs-phase. Die zelluläre Basis der neuralen Differenzierung bildet ein begrenzter Stammzellpool aus selbsterneuernden neuralen Stammzellen (NSZs). Um den Einfluss niedriger und mittlerer Dosen ionisierender Strahlung (IR) auf die adulte Neurogenese zu untersuchen, unterteilten wir den Differenzierungsprozess in seine dynamischen Subpopulationen, die in den einzelnen Differenzierungsphasen abgebildet sind. Basierend auf aus embryonalen Stammzellen generierten neuralen Stammzellen, haben wir ein 2D-Modellsystem entwickelt und charakterisiert, welches die drei Differenzierungsphasen der adulten Neurogenese abbildet. Im ersten Teil dieser Arbeit haben wir die Differenzierung des J1 NSZ Modellsystems hinsichtlich spezifischer Markerprotein Expression, Morphologie und funktioneller Differenzierungsmarker charakterisiert. Die breite Charakterisierung ergab, dass das J1-Modellsystem jede der drei Differenzierungsphasen, d.h. die frühe Vorläufer-phase, die Zellschicksalsspezifikations-phase und die Zellreifungs-phase der adulten Neurogenese sowohl auf intra- und interzellulärer als auch auf funktioneller Ebene in einer synchronisierten, zeitabhängigen Differenzierung widerspiegelt. Wir nutzten die synchrone Differenzierung des J1-Modellsystems um die einzelnen Differenzierungsphasen zeitlich zu diskriminieren. Im zweiten Teil dieser Arbeit analysierten wir die individuelle Radiosensitivität der einzelnen Differenzierungsphasen, wobei wir niedrige bis moderate Röntgendosen zwischen 0,25 und 2Gy verwendeten, in Bezug auf Strahlentherapie und diagnostische Dosen. Um die individuellen Radiosensitivität von neuralen Stammzellen und den drei Differenzierungsphasen zu bestimmen, wurde die Abnahme der Vitalität der einzelnen Subpopulationen nach Bestrahlung ermittelt. Zuzüglich wurde die individuelle mittlere letale Dosis (LD50) jeder Differenzierungsphase bestimmt. Neurale Stammzellen wie auch jede der drei Differenzierungsphasen, zeigte eine individuelle Radiosensitivität, die sich signifikant von der der anderen Subpopulationen unterscheidet. Die proliferativen Subpopulationen, neurale Stammzellen und frühe Vorläuferzellen zeigten die höchste Radiosensitivität, während Zellen in der letzten Differenzierungsphase, der Zellreifung-phase, die niedrigste Radiosensitivität zeigte. In weiterführenden Analysen untersuchten wir die Mechanismen, die für die strahleninduzierten Reduktionen in den einzelnen Subpopulationen ursächlich sind. Innerhalb der postmitotischen Differenzierungsphasen, der Zellschicksalsspezifikation-phase und der Zellreifungs-phase, ist die strahleninduzierte Apoptose der zugrundeliegende Mechanismus. In den proliferativen Subpopulationen wird die Reduktion der Zellzahl überwiegend durch eine reduzierte Proliferation in neuralen Stammzellen und einer induzierten Apoptose in der frühen Vorläufer-phase verursacht. Zur genaueren Untersuchung der Wirkung von ionisierender Strahlung auf einzelne Differenzierungsphasen wurden die drei definierten Differenzierungsphasen getrennt bestrahlt und auf die charakteristischen Differenzierungseigenschaften der jeweiligen Differenzierungsphase mittels funktioneller, morphologischer und histochemischer Marker analysiert. Frühe Vorläuferzellen, die erste Subpopulation innerhalb der neuralen Differenzierung, sind in der Proliferation beeinträchtigt, aber weder die Migration der überlebenden Zellen noch der Übergang in den postmitotischen Zustand wird durch Niedrigdosisstrahlung beeinflusst. Im nächsten Schritt verfolgten wir die Differenzierung von J1-Zellen, die in der Zellschicksalsspezifikations-phase bestrahlt wurden. Die Zellschicksalsbestimmung der überlebenden Zellpopulation zeigte einen reduzierten Anteil an zukünftigen Neuronen nach ionisierender Strahlung im Vergleich zu unbestrahlten Proben. Die terminale Differenzierungsphase zeigte eine breite Modulation in den phasenspezifischen Eigenschaften, hervorgerufen durch Niedrigdosisstrahlung. Wir konnten Veränderungen in der neuronalen Architektur und einer geringeren Dichte synaptischer Marker in Neuroblasten sowie einer reduzierten Dichte des spannungsabhängigen Kaliumkanals KV1.1 bestimmen. Hinsichtlich der funktionelle Ebene fanden wir eine lang anhaltende Stagnation in der Erregbarkeit der, in der Zellreifungs-phase bestrahlten Kulturen, die sich in reduzierter Feuerrate, verminderter Koordination im Aktivitätsmuster und Verlust in der Spike-Synchronität äußerte. Im letzten Teil dieser Arbeit untersuchten wir, ob die Merkmale der sich selbst erneuernden neuralen Stammzellen ebenfalls durch Strahlung beeinflusst sind. In vorangegangenen Arbeiten ermittelte Dr. Bastian Roth, dass funktionelle Merkmale von J1 NSZs nach Niedrigdosisbestrahlung verändert sind. In weiterführenden Experimenten überprüften wir, ob Niedrigdosisstrahlung zu Veränderungen der morphologischen und immunhistologischen Merkmale innerhalb der J1-NSZ-Population führt. Die Weiterverfolgung der bestrahlten neuralen Stammzellen ergab einen hoch signifikanten Anstieg des Differenzierungsmarkers Doublecortin (DCX) innerhalb der sich selbsterneuernden Population. Durch die Verwendung von K+ Kanalblockern während der Bestrahlung konnten wir die Zunahme der DCX-Zellen nach Niedrigdosisstrahlung hemmen. Zusammenfassend fanden wir, im dritten und vierten Teil dieser Arbeit, strahlungsinduzierte Modulationen in den phasenspezifischen Merkmalen jeder Subpopulation, repräsentiert durch neurale Stammzellen und den drei Differenzierungsphasen. Abschließend konnten wir, in einer aus ES-generierten neuronalen Stammzelllinie, abhängig von der Differenzierungsphase, mehrere spezifische physiologische und zelluläre Auswirkungen niedriger und moderate Strahlungsdosen während der neuronalen Differenzierung identifizieren.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Neurophysiology and Neurosensory Systems
Date Deposited: 15 May 2018 11:49
Last Modified: 15 May 2018 11:49
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-73910
Referees: Laube, Prof. Dr. Bodo and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 13 April 2018
URI: https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/7391
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