Ein signifikanter Anteil hereditärer, monogenetischer Erkrankungen wird durch patientenspezifische Mutationen verursacht, die über den gesamten Locus des betroffenen Gens verteilt sind. Obwohl sich in mehreren klinischen Studien die Korrektur dieser Mutationen durch die Einführung gesunder Genkopien in das Genom der erkrankten Zellen bewährt hat und mit fortschrittlicheren Vektoren die Sicherheit und Wirksamkeit verbessert werden kann, bleibt die Insertionsmutagenese und die unregulierte Expression von Genen außerhalb des Einflusses ihrer endogenen Kontrollelemente ein Problem bei der Verwendung von zufällig integrierenden Vektoren. Wie in klinischen Studien wiederholt gezeigt wurde, sind diese Vektoren anfällig für epigenetisches Silencing (Gen-Stilllegung) und können durch Aktivierung benachbarter Protoonkogene Krebs verursachen.

Die Entwicklung von Genom-Editierungs-Technologien, die in der Lage sind, jede vorher festgelegte genomische Sequenz mit bisher unerreichter Präzision zu modifizieren, eröffnete eine breite Palette neuer Möglichkeiten in der Genmanipulation einschließlich gezielter Genreparatur. Insbesondere das prokaryotische adaptive Immunsystem CRISPR/Cas9, fand nach seiner eleganten Umfunktionierung zur Editierung doppelsträngiger DNA wurde als das bisher einfachste Genom-Editierwerkzeug breite Akzeptanz in der wissenschaftlichen Gemeinschaft. In Kombination mit einer einzigen guide RNA (sgRNA) erzeugt die Cas9-Endonuklease DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) an vordefinierten genomischen Loci. Diese DSB können entweder durch Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) oder nicht-homologe Verbindung der Strangenden (NHEJ) repariert werden.

Die Korrektur menschlicher Krankheitsmutationen durch diese Technologie basierte bislang weitgehend auf Homologie-gerichtete Reparatur, die neben RNA-geführten (gRNA) Cas9-Endonukleasen (RGNs) eine exogene homologe Donor-Matrize erfordert. In den meisten Anwendungen wurden RGNs und Matrizen durch Elektroporation in die erkrankten Zellen eingebracht, die auf mehreren Plasmiden kodiert sind, welche jeweils eine der funktionellen Komponenten exprimiert, die für eine gezielte Genmodifikation benötigt werden. Aufgrund dessen, dass die für die Homologie-gerichtete Reparatur (HDR) erforderlichen Komponenten auf verschiedenen Plasmiden liegen und die Elektroporation für die Zielzellen ziemlich schädlich ist, überlebt nur ein kleiner Teil der Zellen die Transfektion und noch weniger beinhalten alle funktionellen Komponenten für die HDR. Infolgedessen ist die Anzahl genkorrigierter Zellen in der Regel recht niedrig und wird durch die inhärente Bevorzugung von NHEJ seitens der Doppelstrangbruch-Maschinerie in Stammzellen noch weiter reduziert.

In dieser Arbeit wird die Effizienz der Genreparatur durch NHEJ in hämatopoetischen Zellen mit patientenspezifischen Punktmutationen im Cytochrom b-245-Gen (CYBB) untersucht, dessen Inaktivierung die lebensbedrohliche Immunschwächekrankheit chronische Granulomatose (X-CGD) verursacht. Obwohl die NHEJ im Gegensatz zu HDR fehleranfällig ist, basierte die vorliegende Arbeit auf der theoretischen Annahme, dass ungefähr ein Drittel der mit NHEJ assoziierten Insertionen/Deletionen (Indels) den korrekten Leserahmen (ORF) wiederherstellen werden, der initial durch eine bestimmte Krankheitsmutation verschoben war. Dies würde zu einer signifikanten Anzahl von ORF-Rekonstitutionen führen, von denen einige, abhängig von der Position und Art der ursprünglichen Mutation, entweder die Proteinfunktion vollständig oder teilweise wiederherstellen sollten. Darüber hinaus wurde erwartet, dass die Donor-Matrize-freie Abgabe von RGNs auf einem statt von mehreren Expressionsvektoren durch lentivirale Infektion die Effizienz der Genreparatur verbessern und die Toxizität der Gentransduktion verringert.

Beim ersten Experimenten zur Bestimmung der Effizienz der Genreparatur durch NHEJ wurden die 32D hämatopoetische Zellen, die vier verschiedene EGFP-Reportertransgene mit N-terminalen Frameshift-Mutationen exprimierten, jeweils mit Cas9 und entsprechenden sgRNAs nukleofektiert. In Übereinstimmung mit früheren Genom-Editierprotokollen, die eine Transfektion beinhalten, war die Effizienz der Gen-Reparatur gering und lag zwischen 2,3% und 5,5%.

Ähnliche Tests wurden in humanen PLB-985 Leukämiezellen durchgeführt, die eine Kopie eines mutationsinaktivierten EGFP-Reporters (mEGFP) exprimierten. Um die Transduktionsraten zu erhöhen und transiente RGN-Expression zu gewährleisten, wurden die RGNs durch Integrations-defekte Lentiviren (IDLVs) transduziert. Im Gegensatz zur Nucleofektion ergab die IDLV-Infektion von RGNs eine hohe On-Target-Mutationsraten, was zu mEGFP-Reparaturraten von bis zu 27% führte. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass sich die mEGFP-Reparatureffizienz um eine Größenordnung verbessert hat, nachdem das RGN Transduktionsprotokoll von Plasmid-Nukleofektion zu IDLV-Infektion geändert wurde.

Anschließend wurde die Strategie bei der hereditären septischen Granulomatose (X-CGD) die durch Mutationen im Cytochrome b-245 beta polypeptide (CYBB) Gen entstehen, in PLB985 Zellen getestet. Dazu wurden vier X-CGD-Patientenspezifische CYBB-Mutationen mit zwei Frameshift-, einer Nonsense- und einer Missense-Mutation einzeln in CYBB-Null-PLB-Zellen (XCGD-PLB) eingebracht. Während der nachfolgenden Transduktion der Zellen mit den entsprechenden IDLV-RGNs, wurden effektiv bis zu 10% die Frameshift-Mutationen korrigiert. Die Reparatureffizienz bei den Nonsense- und Missense-Mutationen war mit weniger als 2% jedoch eher ineffektiv.

Da etwa 20 – 25% der meisten vererbten Bluterkrankungen durch Frameshift-Mutationen verursacht werden, legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass ein Viertel aller an monogenen Blutkrankheiten leidenden Patienten von einer Gentherapie profitieren könnten, die personalisierte, Donor-Template-freie RGNs verwendet.