TU Darmstadt / ULB / TUprints

Integrin β1 cluster stability in the context of cellular mechanosensing and radiosensitivity

Babel, Laura :
Integrin β1 cluster stability in the context of cellular mechanosensing and radiosensitivity.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

[img]
Preview
Text
TUDthesis_final.pdf
Available under CC-BY-NC-ND 4.0 International - Creative Commons Attribution Non-commercial No-derivatives 4.0.

Download (48MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Integrin β1 cluster stability in the context of cellular mechanosensing and radiosensitivity
Language: English
Abstract:

The cellular interaction with the extracellular matrix (ECM) modulates many key processes such as proliferation, migration, differentiation and survival. In addition, resistance to ionizing radiation has been found to be higher in cells cultured in presence of a 3D matrix, a process, which has been termed cell-adhesion mediated radio-resistance (CAM-RR). These cells are able to properly organize ECM-binding (extracellular matrix) integrins containing a β1 subunit into firm and stable clusters. Upon irradiation, these clusters are hard to break. On the contrary, cells cultured under standard, monolayer-based conditions are unable to keep this clustered status and are therefore radiosensitive. Radioresistance is thus linked to the ability to maintain a well defined organization of integrins in clusters, making integrin distribution a potential drug target for radiosensitization. With the use of the integrin β1 inhibitory antibody AIIB2, a well-known radiosensitizer, it is possible to induce radiosensitivity and in combination with ionizing radiation (IR) to break integrin β1 clusters of 3D cultured cells. In 2D cultured cells the treatment with AIIB2 completely abolished integrin clustering. As integrins are the key mediators of cell adhesion and mechanosensing, they originate the molecular signaling towards chromatin remodeling in response to a cell’s microenvironment. By following the physical link from integrins up to the nucleus with single molecule localization microscopy, it was found that the disintegration of integrin clusters has a direct impact on this nuclear mechanosensor. Collectively, these results show that, in addition to biochemical also mechanobiological cues and in particular nuclear mechanosensing have to be considered as relevant to uncover the molecular events behind adhesion related radiosensitivity. Therein, 2D cultured cells are highly artificial and do not provide the means to investigate mechanobiological aspects. Not only the involvement of ECM-binding integrins in radioresistance of various tumor types makes them an important target in actual cancer studies, they also contribute to drugresistance, metastasis and angiogenesis. So far, the vast majority of high-content screenings (HCS) use flat cultured, highly artificial monolayer-based 2D cells and standard microscopy techniques. The here achieved results prove that 3D cell cultures and single molecule microscopy are powerful tools for preclinical screenings. It would be possible to combine the virtues of microscopy of the nanoscale with the capability of 3D cultured cells to enhance the predictive value of high-content-screenings (HCS).

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Zell-basierte High-Content-Screenings (HCS) verwenden zumeist als Monolayer kultivierte 2D Zellen [1]. Dieses Zellkultursystem ist hoch artifiziell, da es mehrere wichtige Aspekte nicht ausreichend nachstellt: (i) 2D kultivierten Zellen fehlt es an Dimensionalität, (ii) es ist ein stark polarisiertes, mechanobiologisches System und (iii) lokale Konzentrationsunterschiede molekularer Gradienten existieren nicht. Im Gegensatz zu dieser klassischen Zellkulturtechnik ahmen sogenannte 3D Zellkultursysteme die in vivo Eigenschaften der natürlichen extrazellulären Matrix (ECM) in Form von z.B. Hydrogelen oder Sphäroidkulturen nach [2]. Hierbei werden physikalische, (bio)chemische und mechanische Eigenschaften berücksichtigt [3, 4]. Zellen, die in einem 3D Zellkultursystem kultiviert werden, weisen im Vergleich zu 2D kultivierten Zellen, unter Anderem eine unterschiedliche Morphologie, Proliferations- und Migrationsrate auf [5, 6, 7]. Auch die Übertragbarkeit der Ergebnisse von 3D Zellkultur basierten Versuchen auf z.B. exprimierte Tumormarker oder medikamentöse Behandlungen, ist deutlich erhöht [9, 8, 10]. Im Gegensatz zu der Standard 2D Zellkultur haben 3D kultivierte Zellen die Möglichkeit mit der ECM zu interagieren [26]. Diese Interaktionen finden durch Signalprozesse an der Plasmamembran statt, wodurch viele Prozesse wie Migration, Proliferation, Differenzierung und Zellüberleben reguliert werden [11, 12, 13]. Integrine sind hierbei die Hauptvermittler der Zell-ECM Interaktion. Dieser Prozess ist besonders interessant, da er im direkten Zusammenhang mit der cell-adhesion-mediated-radio-reistance (CAM-RR) steht, die nur für Zellen beobachtet werden kann, die in 3D kultiviert werden [27]. Bis zu Beginn dieser Thesis wurde die CAM-RR mit Chromatinstrukturen, die sich zwischen 2D und 3D kultivierten Zellen unterschieden, in Zusammenhang gebracht. Hierbei führt ein erhöter Anteil an He- terochromatin von 3D kultivierten Zellen zu einer geringeren Menge an Doppelstrangbrüchen nach einer Bestrahlung mit Röntgenstrahlen. Zum Anderem wurde dieser Prozess mit ECM-bindenden Integrinen, welche eine β1 Untereinheit besitzen, in Verbindung gesetzt [14]. Ziel des ersten Kapitels dieser Arbeit war es, die an der Plasmamembran lokalisierten Effekte ionisierter Strahlung auf β1 Integrine zu untersuchen. Hierfür wurden 3D kultivierte Zellen mit Röntgenstrahlen bestrahlt und die nanoskalige Verteilung der Integrincluster mittels Einzelmolekülmikroskopie untersucht und anschließend quantifiziert. Durch Vergleichsexperimente mit 2D kultivierten Zellen konnte gezeigt werden, dass die Strahlenresistenz der 3D kultivierten Zellen auf ihrer Fähigkeit beruht, Integrincluster besser zu organisieren. Im Gegensatz zu 3D Zellen, weisen 2D kultivierte Zellen eine dynamische und instabile Clusterung der Integrine auf. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass die Signalweiterleitung mittels Integrinen in 2D kultivierten Zellen fehlerhaft ist. Demnach konnte gezeigt werden, dass stabile Integrincluster 3D kultivierter Zellen zu einer Strahlenresistenz, dynamische und instabile Cluster 2D kultivierter Zellen hingegen zu einer Strahlensensitivität führen. Im zweiten Kapitel dieser Arbeit wurde der Integrininhibitor AIIB2 verwendet um die Integrincluster 3D kultivierter Zellen zu destabilisieren und so, in einem kombinierten Ansatz aus Inhibitor und Be- strahlung, eine Strahlensensitiviät zu induzieren. Integrine sind nicht nur für die Zell-ECM Interaktion verantwortlich. Durch eine physikalische Verbindung (u.A. Aktin, die Kernmembranproteine Nesprin und SUN) sind sie mit der nuklearen Lamina verbunden und können so die Chromatinverteilung beeinflus- sen. Durch das Folgen der mechanobiologischen Verbindung zwischen Integrinen und Nukleus konnte nachgewiesen werden, dass die CAM-RR 3D kultivierter Zellen auf ein funktionierendes, ausbalanciertes Mechanoperzeptions-System mit seinem Ursprung in einer korrekten Integrinclusterung beruht. Hingegen besitzen 2D kultivierte Zellen ein nicht funktionsfähiges, artifiziell versteiftes mechanobiologisches System. iii Das dritte Kapitel dieser Dissertation beantwortet die Frage, ob die membranlokalisierten Effekte der Röntgenstrahlung auf das Integrinclustering Lipid-raft abhängig sind. Hierbei wird zudem die ge- neralisierte Abhängigkeit zwischen Raft- und gleichzeitiger Proteinlokalisierung hinterfragt. Integrine und Cholesterolmikrodomänen kolokalisieren, eine Bestrahlung mit einer hohen Dosis ionisierender Strahlung ist jedoch in der Lage Integrine aus diesem System herrauszulösen, während Cholesterolrafts durch die Bestrahlung nicht beeinflusst werden. Dies zeigt, dass (i) die Effekt der ionisierenden Strahlung auf Integrine Lipid-raft unabhängig sind, aber auch, dass (ii) die Kolokalisierung beider Mikrodomänen womöglich voneinander unabhängig sind. Schlussendlich, nur durch einen kombinierten, methodischen Ansatz aus 3D Zellkultur und Einzelmo- lekülmikroskopie war es möglich das Integrinclustering als Target für die Induzierung der Strahlensen- sitivität zu identifizieren. Hierbei ist das durch Einzelmolekülmikroskopie bestimmte Proteinclustering eine erweiterte Form des molekularen Phenotyps, welcher sonst z.B. Proteinaktivitäten beschreibt. Durch die Implementierung der Einzelmolekülmikroskopie und der 3D Zellkultur in ein Phenotyp-basiertes HCS könnten die Vorteile beider Methoden die Aussagekraft solch eines Scrennings bereichern: (i) 3D Zellkulturen spiegeln den in-vivo exprimierten Phenotyp wieder und (ii) Einzelmolekülmikroskopie würde es ermöglich den molekularen Phenotyp zu bestimmen und den Einfluss möglicher Leitstrukturen auf die nanoskalige Verteilung eines Targets zu quantifizieren. Trotz dieser Vorteile basieren vorklinische Screenings zumeist auf artifiziellen 2D Zellkulturen und auf mikroskopischen Methoden, die eine deutlich geringere Auflösung aufweisen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Membrane Dynamics
Date Deposited: 06 Dec 2017 13:38
Last Modified: 06 Dec 2017 13:38
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69899
Referees: Meckel, PD Dr. Tobias and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 11 November 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6989
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year