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Monitoring physiological changes in cells after ionizing radiation using fluorescence lifetime imaging by time resolved single photon counting

Abdollahi Mirzanagh, Elham :
Monitoring physiological changes in cells after ionizing radiation using fluorescence lifetime imaging by time resolved single photon counting.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Monitoring physiological changes in cells after ionizing radiation using fluorescence lifetime imaging by time resolved single photon counting
Language: English
Abstract:

Abstract

Eukaryotic DNA is packed with histone and non-histone proteins into chromatin fibers. The higher order structure of the chromatin comprises loosely packed euchromatin and more densely packed heterochromatin. Euchromatin mainly consists of active gene regions, whereas repressive DNA is mainly included in heterochromatin. Remodeling of the local chromatin structure is critical for the regulation of gene expression and replication of the DNA, but also for repair, if DNA lesions are induced into chromatin. Exposure of the DNA to chemicals or ionizing radiation as well as natural processes can lead to an interruption of its integrity resulting in the formation of double strand breaks, an especially critical type of DNA damage. The inappropriate repair of double strand breaks may lead to genomic instability and finally to the development of cancer. To get further insight into the maintenance of genomic stability, the understanding of cellular responses to double strand breaks is highly required. The chromatin structure and its dynamics are suspected of playing a significant role in the regulation and facilitation of DNA repair. The main aim of this thesis has been to establish a chromatin compaction assay which is working in living mammalian cells and can be easily applied to different cell lines without the necessity of using genetic modifications. The major biological goal was to provide additional and independent evidence of a radiation-induced chromatin decondensation exceeding the hitherto proof based on fluorescence depletion. In addition other potential biological applications of the compaction assay should be explored. To achieve these aims, time correlated single photon counting fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was inspected and characterized in combination with different organic DNA dyes or fluorescent proteins, which might serve as chromatin compaction sensors. To test the irradiation response, the FLIM setup could be coupled to a beamline microscope or, alternatively combined with a 35 kV X-rays tube. The findings demonstrate that some single organic DNA binding dyes revealed a high dynamic range of chromatin compaction with respect to fluorescent histone FRET pairs. These newly established chromatin compaction probes were capable of detecting structural changes of chromatin induced via enzymatic treatments as well as osmolality changes. Furthermore, using postirradiative fixation, the exposure of murine cells to ion irradiation revealed a significant local enhancement of the lifetime values of dyes like Hoechst 34580 at sites of heterochromatic ion traversals, implying a local radiation- chromatin relaxation. Additionally, a global chromatin decompaction after X-rays irradiation could be detected in living cells proving the applicability of this approach as a live cell assay. Besides radiation induced changes, using the small differences in chromatin densities in different cell cycle phases or in resting versus cycling cells could be shown, demonstrating that the established FLIM-based chromatin compaction assay can also successfully applied to other questions or fields in biological research.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Zusammenfassung Eukariotische DNA wird mit Hilfe von Histon- und nicht-Histon Proteinen in Chromatin verpackt. Die höher geordnete Chromatinstruktur lässt sich in ehr locker gepacktes Euchromatin und dichter gepacktes Heterochromatin unterteilen. Während das Euchromatin hauptsächlich die aktiv transkribierten Gene beinhaltet, ist die stillgelegte DNA mehr dem Heterochromatin zuzuordnen. Die Regulation der Genexpression und der Replikation der DNA erfordert eine Remodellierung beziehungsweise Öffnung der Chromatinstruktur, deren Notwendigkeit auch für eine Reparatur, die nach der Induktion von DNA Schäden auftritt, postuliert wird. Diese DNA Schäden können durch die Einwirkung von Chemikalien oder ionisierender Bestrahlung, aber auch durch endogene metabolische Prozesse erzeugt werden. Als besonders kritisch wird dabei der DNA Doppelstrangbruch (DSB) angesehen, da dieser die Integrität des Chromatins zerstört. Eine unsachgemäße Reparatur von DSBs kann zu genomischer Instabilität führen und, letzten Endes, zur Krebsentstehung beitragen. Um einen tiefergehenden Einblick in den Erhalt der genomischen Stabilität zu erlangen ist es deshalb nötig die zellulären Antworten auf Doppelstrangbrüche zu verstehen. Die Chromatinstruktur und -dynamik spielt dabei eine wesentliche Rolle in der Regulation und Förderung der Reparatur. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es einen Assay zu etablieren, der es erlauben sollte die Chromatinkompaktierung in lebenden Säugerzellen zu messen. Zudem sollte er sich ohne großen Aufwand auf unterschiedliche Zellllinien übertragen lassen indem er die Notwendigkeit gentechnischer Veränderung vermeidet. Die Hauptanwendung bestand darin, unabhägige Beweise für das Auftreten strahlungsinduzierter Chromatindekondensation zu erhalten, die über die bisherigen, fluoreszenzintensitätsbasierten Messungen hinausgingen. Zusätzlich sollten alternative biologische Anwendungen des Kompaktierungs-Assays getestet werden. Um diese Ziele zu erreichen wurde die Methode der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (FLIM) basierend auf zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen untersucht und in Verbindung mit verschiedenen organischen DNA Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen, die als Chromatinkompaktierungssensoren dienen sollten, charakterisiert. Um strahlungsbedingte Veränderungen messen zu können, kann der FLIM Aufbau wahlweise an das Strahlplatzmikroskop oder an eine 35kV Röntgenanlage angeschlossen werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass einige der organischen DNA Farbstoffe im Vergleich zu Histon-FRET Paaren einen höheren dynamischen Umfang der Lebensdauerantwort auf Chromatinveränderungen aufweisen. Die neuetablierten Chromatinkompaktierungssensoren sind in der Lage enzymatisch oder osmotisch induzierte Chromatinstrukturveränderungen anzuzeigen. Darüber hinaus konnte in Mäusezellen, die nach der Bestrahlung fixiert wurden, nach Ionenbestrahlung eine lokal signifikant erhöhte Fluoreszenzlebensdauer von Sensoren wie Hoechst34580 am Ort heterochromatischer Ionendurchgänge gezeigt werden. Neben dieser lokalen Chromatindekondensation konnte nach Röntgenbestrahlung eine globale Dekompaktierung in lebenden Zellen nachgewiesen und damit die Anwendbarkeit für Lebendzelluntersuchungen demonstriert werden. Neben strahlungsabhängigen Veränderungen konnten Unterschiede in der Chromatindichte in unterschiedlichen Zellzyklusphasen und ruhenden Zellen gezeigt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der hier etablierte FLIM basierte Chromatinkompaktierungs-Assay auch erfolgreich für andere biologische Fragestellungen verwendet werden kann.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
Divisions: 05 Department of Physics
Date Deposited: 28 Nov 2017 13:47
Last Modified: 28 Nov 2017 13:47
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-69728
Referees: Durante, Prof. Dr. Marco and Drossel, Prof. Dr. Barbara and Nörtershäuser, Prof. Dr. Wilfried and Vogel, Prof. Dr. Michael
Refereed: 16 October 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6972
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