Zusammenfassung

Eukariotische DNA wird mit Hilfe von Histon- und nicht-Histon Proteinen in Chromatin verpackt. Die höher geordnete Chromatinstruktur lässt sich in ehr locker gepacktes Euchromatin und dichter gepacktes Heterochromatin unterteilen. Während das Euchromatin hauptsächlich die aktiv transkribierten Gene beinhaltet, ist die stillgelegte DNA mehr dem Heterochromatin zuzuordnen. Die Regulation der Genexpression und der Replikation der DNA erfordert eine Remodellierung beziehungsweise Öffnung der Chromatinstruktur, deren Notwendigkeit auch für eine Reparatur, die nach der Induktion von DNA Schäden auftritt, postuliert wird. Diese DNA Schäden können durch die Einwirkung von Chemikalien oder ionisierender Bestrahlung, aber auch durch endogene metabolische Prozesse erzeugt werden. Als besonders kritisch wird dabei der DNA Doppelstrangbruch (DSB) angesehen, da dieser die Integrität des Chromatins zerstört. Eine unsachgemäße Reparatur von DSBs kann zu genomischer Instabilität führen und, letzten Endes, zur Krebsentstehung beitragen. Um einen tiefergehenden Einblick in den Erhalt der genomischen Stabilität zu erlangen ist es deshalb nötig die zellulären Antworten auf Doppelstrangbrüche zu verstehen. Die Chromatinstruktur und -dynamik spielt dabei eine wesentliche Rolle in der Regulation und Förderung der Reparatur. Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war es einen Assay zu etablieren, der es erlauben sollte die Chromatinkompaktierung in lebenden Säugerzellen zu messen. Zudem sollte er sich ohne großen Aufwand auf unterschiedliche Zellllinien übertragen lassen indem er die Notwendigkeit gentechnischer Veränderung vermeidet. Die Hauptanwendung bestand darin, unabhägige Beweise für das Auftreten strahlungsinduzierter Chromatindekondensation zu erhalten, die über die bisherigen, fluoreszenzintensitätsbasierten Messungen hinausgingen. Zusätzlich sollten alternative biologische Anwendungen des Kompaktierungs-Assays getestet werden. Um diese Ziele zu erreichen wurde die Methode der Fluoreszenzlebensdauermikroskopie (FLIM) basierend auf zeitkorrelierten Einzelphotonenmessungen untersucht und in Verbindung mit verschiedenen organischen DNA Farbstoffen oder fluoreszierenden Proteinen, die als Chromatinkompaktierungssensoren dienen sollten, charakterisiert. Um strahlungsbedingte Veränderungen messen zu können, kann der FLIM Aufbau wahlweise an das Strahlplatzmikroskop oder an eine 35kV Röntgenanlage angeschlossen werden. Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass einige der organischen DNA Farbstoffe im Vergleich zu Histon-FRET Paaren einen höheren dynamischen Umfang der Lebensdauerantwort auf Chromatinveränderungen aufweisen. Die neuetablierten Chromatinkompaktierungssensoren sind in der Lage enzymatisch oder osmotisch induzierte Chromatinstrukturveränderungen anzuzeigen. Darüber hinaus konnte in Mäusezellen, die nach der Bestrahlung fixiert wurden, nach Ionenbestrahlung eine lokal signifikant erhöhte Fluoreszenzlebensdauer von Sensoren wie Hoechst34580 am Ort heterochromatischer Ionendurchgänge gezeigt werden. Neben dieser lokalen Chromatindekondensation konnte nach Röntgenbestrahlung eine globale Dekompaktierung in lebenden Zellen nachgewiesen und damit die Anwendbarkeit für Lebendzelluntersuchungen demonstriert

werden. Neben strahlungsabhängigen Veränderungen konnten Unterschiede in der Chromatindichte in unterschiedlichen Zellzyklusphasen und ruhenden Zellen gezeigt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der hier etablierte FLIM basierte Chromatinkompaktierungs-Assay auch erfolgreich für andere biologische Fragestellungen verwendet werden kann.