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Toluol wird unter anaeroben Bedingungen durch das denitrifizierende ß-Proteobakterium Thauera aromatica abgebaut. Die initiale Reaktion des anaeroben Toluol-Stoffwechsels ist die Addition der Methylgruppe von Toluol an die Doppelbindung von Fumarat. Dieser Schritt, bei dem (R)-Benzylsuccinat entsteht, wird durch das Enzym (R)-Benzylsuccinat-Synthase katalysiert. Dieses Enzym gehört zur Familie der Glycylradikalenzyme und wird erst posttranslational durch ein aktivierendes Enzym zur aktiven, Radikal-haltigen Form umgesetzt. (R)-Benzylsuccinat wird dann über ß-Oxidation weiter zu Benzoyl-CoA umgesetzt, einem zentralen Intermediat des anaeroben Aromatenstoffwechsels, dessen weiterer Abbauweg bereits gut bekannt ist. Ziel dieser Arbeit war es, durch spektroskopische, strukturelle und biochemische Studien die (R)-Benzylsuccinat-Synthase und das aktivierende Enzym zu charakterisieren. Ein weiteres Ziel bestand in der Charakterisierung der noch nicht untersuchten Enzyme der ß-Oxidation von (R)-Benzylsuccinat. Die Enzymaktivität der (R)-Benzylsuccinat-Synthase wurde bis jetzt nur im Rohextrakt von Thauera aromatica nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass gereinigte rekombinante (R)-Benzylsuccinat-Synthase in vitro durch das aktivierende Enzym aktiviert wird. Durch UV/Vis- und ESR-Spektroskopie wurden außerdem zwei [Fe3S4]-Zentren als zusätzliche Kofaktoren der (R)-Benzylsuccinat-Synthase identifiziert. Durch ESR-Analysen nach Behandlung des Enzyms mit den Inhibitoren CO, NO und Cyanid wurde der Nachweis erbracht, dass diese Fe-S-Zentren am Mechanismus des Enzyms beteiligt sind. Es wurden Bedingungen gefunden, unter denen gereinigte rekombinante (R)-Benzylsuccinat-Synthase Kristalle bildete, die für eine Röntgenstrukturanalyse eingesetzt werden konnten und bereits bis zu einer Auflösung von 8,0 Å streuten. Das aktivierende Enzym der (R)-Benzylsuccinat-Synthase war in aktiver Form bis jetzt nur im Rohextrakt von Thauera aromatica nachzuweisen. Mit dieser Arbeit wurde es zum ersten Mal in löslicher und funktionell aktiver Form in E. coli überproduziert. (E)-Phenylitaconyl-CoA ist ein Intermediat der ß-Oxidation von (R)-Benzylsuccinat und wird durch eine (E)-Phenylitaconyl-CoA Hydratase zu (Hydroxymethylphenyl)succinyl-CoA umgesetzt. Das Enzym wurde heterolog in E. coli überproduziert, gereinigt und charakterisiert. Es handelt sich dabei um ein Homotetramer aus 28 kDa-Untereinheiten. Der Km-Wert für (E)-Phenylitaconyl-CoA liegt bei 104 +/- 34 µM, die spezifische Aktivität bei 52 µmol min –1 [mg-1 Protein]. Die (Hydroxymethylphenyl)succinyl-CoA Dehydrogenase oxidiert (Hydroxymethylphenyl)succinyl-CoA zu Benzoylsuccinyl-CoA. In einem gekoppelten Enzymtest wurde die Enzym-abhängige NAD-Reduktion gezeigt. |
| Alternative Abstract: |
| Alternative Abstract | Language |
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Toluene is degraded under anaerobic conditions by the denitrifying ß-proteobacterium Thauera aromatica. The initial reaction of the anaerobic catabolism of toluene is the addition of the methyl group of toluene on the double bond of fumarate. This first step is catalysed by the enzyme (R)-benzylsuccinate synthase and yields (R)-benzylsuccinate. This enzyme belongs to the family of glycyl radical enzymes. Similar to other members of this enzyme family an activating enzyme introduces the radical posttranslationally into benzylsuccinate synthase. Benzylsuccinate synthase is only active in this radical-containing form. (R)-Benzylsuccinate is oxidised by a ß-oxidation pathway to benzoyl-CoA which is a central intermediate of anerobic aromatic metabolism. Its further degradation is well understood. One topic of this work was the characterisation of benzylsuccinate synthase and its activating enzyme by spectroscopic, structural and biochemical investigations. A second topic was the characterisation of enzymes of the ß-oxidation of benzylsuccinate which had not been investigated prior to the work. Until now, enzyme activity of benzylsuccinate synthase was only detected in crude extract of T. aromatica. In this work it was shown for the first time that purified benzylsuccinate synthase is activated by the activating enzyme in vitro. Two [Fe3S4]-clusters were identified as additional cofactors by UV/Vis- and EPR spectroscopy. EPR-studies of benzylsuccinate synthase treated with CO, NO and cyanide revealed that the detected [Fe3S4]-clusters are involved in enzyme mechanism. Conditions were found under which purified recombinant benzylsuccinat synthase formed crystals. They diffracted in X-ray crystallographic analysis to about 8 Å. Till now the activity of the activating enzyme was only detected in crude extract of T. aromatica. In this work, the enzyme was overproduced for the first time in a soluble and functional active form in E. coli. (E)-Phenylitaconal-CoA is an intermediate of the ß-oxidation of (R)-benzylsuccinate. It is converted by (E)- phenylitaconyl-CoA hydratase to (hydroxymethylphenyl)succinyl-CoA. The enzyme was overproduced heterologously in E.coli, purified and characterised. The composition of the enzyme was identified as a homotetramer composed of subunits of 28 kDa. The Km-value of (E) phenylitaconyl CoA was to 104 ± 34 µM, and the specific activity of the enzyme to 52 µmol min -1 [mg -1 protein] determined. The next step of the pathway is catalysed by (hydroxymethylphenyl)succinyl CoA dehydrogenase, which oxidises (hydroxymethylphenyl)succinyl-CoA to benzoyl-CoA. The enzyme was purified and the substrate-dependent reduction of NAD was shown in a coupled enzyme test with (E)-phenylitaconyl-CoA hydratase. | English |
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