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Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat

Fuck, Sebastian :
Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Kurz- und Langzeiteffekte ionisierender Strahlung auf die T-Zelllinie Jurkat
Language: German
Abstract:

Die schädigende Wirkung ionisierender Strahlung auf humane Zellen ist seit Jahrzehnten bekannt und wird besonders in der Strahlentherapie genutzt um gezielt Tumore abzutöten. Neben der gezielten Bestrahlung des Tumorgewebes wird auch immer gesundes Gewebe bestrahlt. Die Auswirkungen dieser subletalen Dosen sind weniger gut erforscht. Die Strahlenhormesis beschreibt Prozesse bei denen geringe Strahlendosen sogar positive Effekte auf Zellen haben können. Besonders Immunzellen scheinen durch die Strahlung angeregt zu werden, da sie nach einer Bestrahlung Tumorgewebe effizienter bekämpfen können (Liu 2006). Im Zusammenhang mit der Immuntherapie ist die Wirkung der Bestrahlung auf Immunzellen von fundamentaler Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit wird eine strahleninduzierte Veränderung des Aktivierungszustands der Leukämie T-Zelllinie Jurkat mit den zugrundeliegenden Signalkaskaden untersucht. Eine Bestrahlung von Jurkat Zellen führt zu einer deutlichen morphologischen Änderung und einem veränderten Expressionslevel eines Markers, der für die Aktivierung von T-Zellen charakteristisch ist. In Abhängigkeit von der Dosis vergrößert sich der Zelldurchmesser 48 h nach Bestrahlung. Die Expression von Interleukin-2, einem Zytokin, das bei der normalen Immunantwort infolge einer Aktivierung exprimiert wird, wird hochreguliert. Strahlung bewirkt keine Veränderung der Expression von RNF-128, einem Protein, das T-Zellen exprimieren, wenn sie in den inaktiven Zustand der Anergie wechseln. Obwohl Interleukin-2 hochreguliert wird, konnte keine Zunahme der CD25 Expression nach Bestrahlung beobachtet werden. CD25 wird nur nach einer vollständigen Aktivierung durch Antigen und Costimulus produziert. Die Vermutung, dass eine Signalkaskade über ROS und Calcium, die in vorausgehenden Arbeiten beschrieben wurde, für diese Aktivierung verantwortlich ist, konnte nicht vollends als Ursache bestätigt werden. Mit dem genetisch kodierten H2O2 Sensor HyPer konnte mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung gezeigt werden, dass ionisierende Strahlung das ROS Level in Jurkat Zellen erhöht, wobei die Zellen jedoch einen sehr großen Bereich an H2O2 Änderungen zeigten. Wenn ein Anstieg an H2O2 durch in den Zellen durch extern appliziertes H2O2 nachgeahmt wurde, erhöhte sich die intrazelluläre Calciumkonzentration in einer charakteristischen oszillierenden Art und Weise, die auf einen Calcium induzierte Calcium Freisetzung als Signalantwort schließen lässt. In direkten Messungen der Calciumkonzentration in bestrahlten Jurkat Zellen war es jedoch nicht möglich mit dem chemischen Calciumsensor Fluo-4 eine direkte Auswirkung der Strahlung auf die intrazelluläre Calciumkonzentration innerhalb von wenigen Minuten nach Zusammenfassung 5 Bestrahlung nachzuweisen. Während diese Daten andeuten, dass Calcium keine Rolle in der frühen Reaktion von Zellen auf Strahlung spielt, so zeigen anderen Daten, dass dieser second messenger in späteren Reaktionen beteiligt ist. Mit dem Calciumchelator war es möglich eine strahleninduzierte Vergrößerung der Jurkat Zellen gänzlich zu verhindern. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass eine verzögerte Auswirkung des Calciums eine Rolle in dem Prozess der Zellvergrößerung hat. Ein Abfangen der nach Strahlung entstandenen ROS durch ROS scavenger hatte keinen Effekt auf die Vergrößerung. Eine Rolle der ROS für eine Aktivierung konnte ungeachtet dessen durch eine 10 minütige Behandlung mit H2O2 gezeigt werden; in dem Fall ersetzt eine kurze Inkubation der Zellen in H2O2 die Strahlenexposition. Die Versuche zeigen, dass H2O2 zu einer konzentrationsabhängigen Vergrößerung der Zellen führt, die in ihrem Maximum halb so stark wie die maximale Vergrößerung nach einer Bestrahlung war. Eine Vergrößerung in gleichem Maße wie nach einer Behandlung mit H2O2 konnte durch den G2-Zellzyklus Inhibitor RO3306 erreicht werden. Zusammen führen diese Daten zur Hypothese, dass 50 % der Vergrößerung der Jurkat Zellen nach Bestrahlung auf eine Signalkaskade über ROS zustande kommen und die übrigen 50 % aus einem G2- Zellzyklussarrest resultieren. In Kontrollversuchen hatte sich gezeigt, dass die entsprechenden H2O2 Behandlung keinen Einfluss auf einen G2-Zellzyklusarrest haben. Für die Aktivierung von Jurkat Zellen kommt hingegen eine Signalkaskade infrage, die auch durch ROS induzierbar ist, da kein Zusammenhang zwischen einem G2-Arrest und einer veränderten Transkription oder Aktivierung von T-Zellen bekannt ist. Proteine der DNA Reparatur gehören zu den Proteinen, die unmittelbar auf die Bestrahlung reagieren können. Sie sind nicht nur in der Lage DNA-Schäden zu reparieren, sondern können überdies Zellen im Zellzyklus arretieren. Proteine der DNA Reparatur wurden als Auslöser der Aktivierung und Vergrößerung vermutet. Daher wurden DSB Reparaturproteine durch Inhibitoren inaktiviert. Die Inhibition des Reparaturproteins ATR hatten nicht nur zur Folge, dass die strahleninduzierte Vergrößerung verhindert wurde, sondern auch die Arretierung im Zellzyklus teilweise aufgehoben wurde. Letzteres äußerte sich dadurch, dass Jurkat Zellen selbst nach einer Strahlendosis, die ausreicht um einen kompletten Zellzyklusarrest zu initiieren, weiter proliferierten. Dies führt zur Hypothese, dass ionisierende Strahlung durch direkte und indirekte Effekte einzelsträngige Bereiche der DNA erzeugt, wodurch ATR rekrutiert wird, das einerseits einen Zellzyklusarrest initiiert und andererseits eine Vergrößerung und Aktivierung der Jurkat Zellen über zytosolische Signalmoleküle bewirkt. Die Bedeutung des Reparaturproteins ATR für das Zellschicksal ist folglich größer als bisher angenommen. ATR könnte daher das zentrale Protein sein, das für positive Effekte im Zuge der Strahlenhormesis sorgt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The damaging effects of ionizing radiation on human cells are well known for years and this knowledge is extensively used in the radiation therapy to treat tumors. In addition to the selective irradiation of tumor tissue the surrounding healthy tissue is also affected by the radiation. The effects of these sublethal doses are poorly understood. Radiation hormesis is described as an positive effect of small radiation doses for cells. Especially cells of the immune system seem to be stimulated by the radiation, because their ability to eliminate the tumor tissue is increased after radiation (Liu 2006). In the context of immune therapy it is of tremendous interest to understand the effect of radiation on immune cells. Radiation induced stimulation and activation of the human leukemic T-cell line Jurkat and the underlying signaling cascades are investigated in this study. The radiation of Jurkat cells leads to an obvious morphological change and influences the expression of typical markers for the immune activation of t-cells. 48 h after irradiation the diameter of Jurkat cells increases in a dose-dependent manner. In addition the expression of the cytokin Interleukin-2 (IL-2) is also upregulated. IL-2 is normally expressed due to activation of the t-cells by antigen stimulation. Radiation has no influence on the expression level of RNF-128. This protein is a typical marker for anergic t-cells and is expressed, if they are insensitive to stimulation. Although an upregulation of IL-2 was detected, the expression of CD25 was not influenced by the radiation. CD25 is only produced by fully activated T-cells, which are stimulated by an antigen and a costimulation. The hypothesis that a signaling cascade via ROS and calcium is induced, which was characterized in a previous work, could not completely be proven. The genetically encoded H2O2 sensor HyPer showed with a high spatial and temporal resolution that ionizing radiation elevates the level of intracellular ROS, but the magnitude of this elevation varied a lot. If this elevation of the intracellular ROS concentration by radiation was mimicked with externally applied H2O2, [Ca2+]cyt oscillated in a manner, which is characteristic for a process called calcium induced calcium release. Direct measurements of [Ca2+]cyt with the calcium indicator Fluo-4 did not reveal any change of [Ca2+]cyt within a few minutes after radiation. While this data is not indicating a role of [Ca2+]cyt in the early reactions straight after the radiation, other data shows a delayed effect of calcium. The calcium chelator BAPTA-AM diminished a radiation induced diameter increase completely. Scavenging of the radiation induced ROS did not affect the diameter increase at all. Nevertheless ROS seem to be involved in the radiation induced diameter increase, because a short treatment with different concentrations of H2O2 increased the diameter of Jurkat cells in Abstract 8 a concentration-dependent manner. The maximum of the H2O2 induced diameter increase was only half of the radiation induced effect. The same diameter increase as with H2O2 was accomplished with a G2 arrest induced by the CDK1 inhibitor RO3306. Altogether the data leads to the hypothesis that 50 % of the radiation induced diameter increase of Jurkat cells is related to a G2-arrest and the other 50 % are related to a ROS mediated signaling cascade. Control experiments did not show any effect of H2O2 treatment on the G2-arrest. The activation process after ionizing radiation is attributed to the signaling cascade via ROS, because there is no influence of the G2-arrest on the transcription or activation of t cells known. Proteins of the DNA repair perform the first reaction after ionizing radiation. In addition to their ability to repair damaged DNA segments, they are able to initiate an effective cell cycle arrest. Proteins of the DNA repair are supposed to be the trigger for the activation and the diameter increase. The inhibition of the repair protein ATR did not only prevent the radiation induced diameter increase, but also abrogated the G2-arrest. Jurkat cells treated with the ATR inhibitor were able to proliferate, although they were irradiated with a dose which induces a complete G2-Arrest. This leads to the hypothesis that ionizing radiation generates single- stranded DNA and double-strand breaks via direct and indirect effects, which recruits ATR. ATR initiates on the one hand efficiently a G2-arrest and on the other hand a diameter increase and an activation of Jurkat cells, which is related to a cytosolic signaling cascade. The importance of the DNA repair protein ATR was underestimated for several years. ATR could be the key protein for positive effects of the radiation hormesis.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Membrane Biophysics
DFG-Graduiertenkollegs > Research Training Group 1657 Molecular and cellular responses to ionizing radiation
Date Deposited: 29 Aug 2017 08:26
Last Modified: 29 Aug 2017 08:26
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-67401
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Laube, Prof. Dr. Bodo
Refereed: 11 August 2017
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6740
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