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Isolierung symbiosespezifischer Gene aus Geosiphon pyriformis und funktionelle Charakterisierung des ersten Glomeromycota-Zuckertransporters

Martin, Holger :
Isolierung symbiosespezifischer Gene aus Geosiphon pyriformis und funktionelle Charakterisierung des ersten Glomeromycota-Zuckertransporters.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2006)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Isolierung symbiosespezifischer Gene aus Geosiphon pyriformis und funktionelle Charakterisierung des ersten Glomeromycota-Zuckertransporters
Language: German
Abstract:

Die vorliegende Arbeit befasst sich auf molekularer Ebene mit Geosiphon, einer bislang einzigartigen Endosymbiose zwischen einem Pilz (Geosiphon pyriformis) und dem Cyanobakterium Nostoc punctiforme. Das symbiontische Konsortium hat viele Ähnlichkeiten mit der arbuskulären Mykorrhiza und kann in mancher Hinsicht als Modell für diese dienen. In dieser Arbeit wurde ein Zuckertransporter, der möglicherweise am Nährstoffaustausch zwischen den Symbionten beteiligt ist, isoliert und teilweise charakterisiert. Zu Beginn wurde eine verlässliche Methode zur Isolation von mRNA aus geringen Mengen an Geosiphon-Blasen entwickelt. Dabei wurde ein mRNA-Gehalt von ca. 0,2 ng pro Blase ermittelt. Weiter wurde ein Verfahren zur cDNA-Synthese etabliert. Klonierte cDNA-Sequenzen wurden sequenziert und zeigten eine sehr gute Qualität; z.B. zeigte keine der Sequenzen Homologien zu Nostoc-Genen. Pilzliche und bakterielle mRNA können somit durch die etablierten Methoden sehr effektiv getrennt werden. Aufbauend auf den genannten Methoden wurde eine subtraktive cDNA-Bank hergestellt. Die verwendete cDNA wurde aus 72 h im Licht bzw. im Dunkeln inkubierten Geosiphon-Blasen gewonnen. 282 Klone der subtraktiven Bank wurden durch differentielles Screening nach Genen durchsucht, deren Expression lichtreguliert ist. Fünf solcher cDNA-Sequenzen wurden identifiziert; vier davon (hm24-E11, hm24-H4, hm26-H3 und hm27-F2) zeigten schwache Ähnlichkeiten zu Transportproteinen bzw. Komponenten von Transportsystemen. Die Sequenz hm26-H3 hatte schwache Ähnlichkeit zu einem Zuckertransporter eines Basidiomyceten. Die differentielle Expression dieser Gene im Licht, bzw. im Dunkeln, konnte durch unabhängige, semiquantitative RT-PCR Kontrollexperimente jedoch nicht bestätigt werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde aus Geosiphon pyriformis cDNA eine größenfraktionierte Hefeexpressions-cDNA-Bank mit 6*105 E. coli-Klonen hergestellt. Durch funktionelle Komplementation der Hefemutante EBY VW4000 mit Plasmiden dieser Bank wurde eine 1845 bp lange cDNA-Sequenz des Zuckertransportergens Gphxt1 charakterisiert. Diese zeigte auf Aminosäureebene ca. 40 % Ähnlichkeit zu anderen Zuckertransportern. Aus der cDNA-Sequenz wurden drei offene Leserahmen (ORF) mit einer Länge von 432, 480, und 496 Aminosäuren (AS) abgeleitet. In den ORFs wurden konservierte Bereiche, sowie 11 bzw.12 Transmembran-Helices identifiziert. Anhand dieser Ergebnisse wurde GpHXT1p in die major facilitator superfamily (MFS) eingeordnet. Die cDNA-Sequenz des ORF mit 496 AS Länge beginnt ohne Startkodon, was darauf hinweist, dass die cDNA möglicherweise trunkiert ist. Die vermutete Vollängen-mRNA von Gphxt1 könnte somit für mehrere funktionelle Zuckertransporter kodieren. Wachstumstests mit heterolog exprimierenden Hefen ergaben, dass GpHXT1p das Wachstum der komplementierten Hefe in folgender Intensität ermöglicht: Bei Substratkonzentrationen >50 mM D-Mannose>D-Glukose>D-Fruktose>>D-Galaktose. Bei Substratkonzentrationen D-Glukose>>D-Galaktose>D-Fruktose. Untersuchungen zum Transportmechanismus von GpHXT1p an heterolog exprimierenden Hefen bzw. Oozyten von Xenopus laevis zeigten, dass der Substrattransport im Symport mit Protonen erfolgt. Aufnahmemessungen mit 14C-Glukose und der komplementierten Hefe ergaben folgende Werte für die Transportkinetik von GpHXT1p: KM = ca. 60 mM Glukose; Vmax = ca. 0,15 nmol Glukose*10-5 Zellen*min-1. GpHXT1p kann somit als „low-affinity“-Transporter klassifiziert werden. Durch ein RT-PCR-Experiment konnte gezeigt werden, dass eine Inkubation von Geosiphon-Blasen von ≥ 72 h im Dunkeln eventuell eine Verringerung der Expression von Gphxt1 im Vergleich zu belichteten Proben bewirkt. Gphxt1 könnte ein Schlüsselgen für die Funktion der Geosiphon-Symbiose darstellen. Die Ergebnisse werden im Zusammenhang mit ihrer möglichen Bedeutung für die Aufklärung des Stofftransportes zwischen den Symbiospartnern von Geosiphon und für die Weiterentwicklung der Erforschung von Geosiphon auf genomischer Ebene diskutiert. Die Kenntnis der cDNA-Sequenz von Gphxt1 wird wahrscheinlich zur Isolierung von Zuckertransporter-Genen aus anderen AM-Pilzen führen. Mit Hilfe der erstellten Hefeexpressions-cDNA-Bank können in Zukunft weitere Gene aus Geosiphon pyriformis isoliert und funktionell charakterisiert werden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The presented thesis analyses the unique interaction between the fungus Geosiphon pyriformis and the Cyanobacterium Nostoc punctiforme at the molecular level. This symbiosis shows a lot of similarities to the arbuscular mycorrhiza (AM) and therefore Geosiphon could provide a model system for for further analysis of the AM. In this work a sugar transporter probably involved in the nutrient exchange between the symbionts was isolated and partially characterised. A reliable method for the isolation of mRNA from small amounts of Geosiphon bladders was developed. A concentration of approx. 0.2 ng mRNA per bladder was measured. Furthermore a method for the synthesis of cDNA was established. Cloned cDNA-Fragments were sequenced and showed a good quality; e.g. none of these sequences showed homologies to Nostoc sequences. With the established methods it was possible to separate fungal and bacterial mRNA easily. Subsequently, a subtractive cDNA-library was constructed. The used cDNA was synthesized from Geosiphon bladders which were pre-incubated for 72 hours in the light or for 72 hours in darkness respectively. 282 clones of the subtractive library were differentially screened for genes whose expression is regulated by light. Five of such sequences were identified; four of these (hm24-E11, hm24-H4, hm26-H3 and hm27-F2) showed weak similarities to transport proteins or to components of transport systems. The sequence hm26-H3 showed a weak similarity to a basidiomycete-like sugar transporter. Unfortunately differential expression of these genes in light or in darkness could not be confirmed by independent, semiquantitative RT-PCR control-experiments. Subsequently, a size-fractionated yeast-expression cDNA-library with 6*105 E. coli clones was constructed from Geosiphon pyriformis-cDNA. By functional complementation of the yeast mutant EBY VW4000 with plasmids from this library the 1845 bp long cDNA-fragment of the sugar transporter gene Gphxt1 was isolated. The cDNA-sequence showed 40 % similarity at the amino acid level to other sugar transporters. From this cDNA-sequence three open reading frames with a length of 432, 480 and 496 amino acids could be derived. Conserved regions and 11 to 12 transmembran helices were detected in the open reading frames. According to these results GpHXT1p was characterised as a member of the major facilitator superfamily (MFS). The cDNA-sequence of the 496 aa long open reading frame begins without a start-codon. This indicates that the cDNA possibly is truncated. The supposed full- length mRNA of Gphxt1 could possibly code for sugar transporters with multiple, size and function. Growth tests with heterologous expressing yeast revealed that GpHXT1p supports the growth of the yeast with the following intensity: Substrate concentration > 50 mM: D-Mannose > D-Glucose > D-Fructose >> D-Galactose Substrate concentration < 50 mM: D-Mannose > D-Glucose >> D-Galactose> D-Fructose The analysis of the transport mechanism of GpHXT1p with heterologously expressing yeast showed that the substrate is co-transported with protons. Uptake measurements with 14C-Glucose and the complemented yeast mutant resulted the following values for the transport kinetics of GpHXT1p : KM = approx. 60 mM Glucose; Vmax: approx. 0.15 nmol Glucose * 10-5 cells*min-1. According to this, GpHXT1p could be characterised as a low afffinity transporter. A RT-PCR experiment showed that a incubation of Geosiphon bladders for 72 hours in darkness possibly reduces the expression of Gphxt1 in comparison to light-incubated bladders. Gphxt1 may be considered as a key-gene for the function of the Geosiphon-symbiosis. The results are discussed because of their possible meaning in the enlightenment of nutrient exchange mechanisms between the symbiosis partners of Geosiphon and for the development of the research activities on Geosiphon at the genomic level. The Cognition of the cDNA-sequence of Gphxt1 probably will lead to the Isolation of sugar transporters from other AM-fungi. In future more genes from Geosiphon pyriformis will be isolated and probably characterised via the constructed yeast-expression cDNA-library.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:51
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000669
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-6696
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Schuessler, PD Dr. Arthur and Thiel, Prof.Dr. Gerhard
Advisors: Schuessler, PD Dr. Arthur
Refereed: 21 December 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/669
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