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Schwefel-Oxygenasen/-Reduktasen aus Acidianus ambivalens und Halothiobacillus neapolitanus

Pöll, Uwe :
Schwefel-Oxygenasen/-Reduktasen aus Acidianus ambivalens und Halothiobacillus neapolitanus.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2017)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Schwefel-Oxygenasen/-Reduktasen aus Acidianus ambivalens und Halothiobacillus neapolitanus
Language: German
Abstract:

Die Schwefel-Oxygenase/-Reduktase (SOR) ist das initiale Enzym der Schwefeloxidation im acidothermophilen und chemolithoautotrophen Archaeon Acidianus ambivalens (AaSOR). Das Enzym katalysiert eine sauerstoffabhängige Disproportionierung von elementarem Schwefel mit Sulfit, Thiosulfat und Schwefelwasserstoff als nachweisbaren Produkten. Der Reaktions-mechanismus dieser Disproportionierungsreaktion ist jedoch weitestgehend unbekannt. Das bislang angenommene Temperaturspektrum der AaSOR erstreckt sich über einen Bereich von 50 - 108 °C. Die Optimierungen des SOR-Aktivitätstests und der zugehörigen Nachweisreaktionen in dieser Arbeit ergaben, dass die AaSOR auch bei niedrigeren Temperaturen von bis zu 10 °C aktiv ist. Eine SOR-Aktivität im Temperaturbereich unter 50 °C ist somit nicht länger als spezielle Adaption von SORs an mesophile Habitate anzusehen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Thiosulfat kein primäres Reaktionsprodukt der SOR darstellt, sondern ausschließlich durch eine chemische, nichtenzymatische Reaktion von Sulfit und elementarem Schwefel bei hohen Temperaturen gebildet wird. Das aktive Zentrum der AaSOR umfasst drei hochkonservierte Cysteine (C31, C101 und C104), von denen C31 persulfuriert vorliegt (CSS31) und aufgrund der für die Katalyse essentiellen Funktion als Substratbindungsstelle vermutet wird. Zur Überprüfung dieser These wurden organische, schwefelhaltige Moleküle gesucht, die als Substratanaloga einen inhibitorischen Effekt auf die SOR ausüben. Als geeignet stellten sich die Oligosulfid-Verbindungen Diallyltrisulfid, Dimethyldisulfid, Di-tert-butyl-Polysulfid und artifizielles Knoblauchöl heraus. Die Identifikation der zugehörigen Bindungsstellen erfolgte mittels Röntgenkristallographie. Die Kristallstrukturen wiesen eine Modifikation aller drei konservierten Cysteine ohne spezifische Modifikation einer einzelnen Aminosäure im aktiven Zentrum auf. Die Funktion von CSS31 als Substratbindungsstelle konnte auf diesem Weg nicht verifiziert werden. Neben den drei konservierten Cysteinen umfasst das aktive Zentrum der SOR ein mononukleäres Eisenatom, das durch eine faciale 2-His-1-Carboxylat-Triade und zwei Wassermoleküle koordiniert wird. Die sekundäre Koordinationssphäre wird durch E87 gebildet, das über eine Wasserstoffbrückenbindung in Kontakt mit dem Eisenliganden H86 steht. Die Substitution von E87 zu Alanin bewirkte eine Aktivitätsverringerung auf 26 %, wohingegen die Mutante E87D eine zum Wildtyp vergleichbare Aktivität aufwies. Die sekundäre Koordinationssphäre wirkt über die Wasserstoffbrückenbindung entscheidend auf das Eisenzentrum und die enzymatische Aktivität ein. Frühere ESR-Experimente zeigten, dass die Inkubation des Enzyms zusammen mit Schwefel bei hohen Temperaturen einen Wechsel des Redoxzustands von Fe3+ zu Fe2+ bewirkt. Um zu prüfen, ob dieser Wechsel einen essentiellen Bestandteil der SOR-Katalyse darstellt, wurde das im aktiven Zentrum der SOR enthaltene Eisen durch hochreines Cobalt, Gallium, Mangan und Nickel substituiert. Alle SOR-Derivate waren biochemisch aktiv. Co- und Mn-SOR zeigten für Co2+- und Mn2+-Spezies charakteristische ESR-Signale, die auch nach der Inkubation mit Schwefel bei hohen Temperaturen erhalten blieben. Der Oxidationszustand der Substitutionsmetalle blieb bei der Katalyse unverändert. Dies lässt darauf schließen, dass kein Redoxwechsel des Metallzentrums bei der Sauerstoffaktivierung nötig ist. Untersuchungen der Kristallstrukturen lieferten keine neuen Erkenntnisse bezüglich struktureller Unterschiede in den aktiven Zentren der SOR-Derivate. Sowohl die Analysen mittels Röntgenfluoreszenzspektroskopie als auch die Daten der anomalen Dispersion ergaben, dass die Metallzentren neben den eingebrachten Substitutionsmetallen auch von unerwünschten Metallionen besetzt waren. ICP-MS-Analysen der unter hochreinen Bedingungen präparierten SOR-Derivate bestätigten, dass die festgestellten Kontaminationen im Rahmen des Kristallisationsprozesses oder der Kristallpräparation eingebracht wurden. Die in einer früheren Arbeit begonnene strukturelle Charakterisierung der SOR aus dem mesophilen γ-Proteobakterium Halothiobacillus neapolitanus (HnSOR) wurde in dieser Arbeit fortgesetzt. Es gelang eine Kristallstruktur mit einer Auflösung von 2,1 Å zu erhalten, wobei Proteinarchitektur und aktives Zentrum eine hohe Ähnlichkeit zur AaSOR aufweisen. Neben der bereits bekannten Persulfurierung von C33 wurde auch an den beiden Cysteinen C103 und C106 ein zusätzliches Schwefelatom beobachtet. C103 und C106 scheinen dabei über eine Tetrasulfidbrücke miteinander verbunden zu sein. Das mononukleäre Eisenzentrum wird, wie bei der AaSOR, von drei Aminosäuren (H88, H92 und E116) und zwei Wassermolekülen koordiniert. Die sekundäre Koordinationssphäre wird nicht von dem zu E87 der AaSOR homologen E89 gebildet, sondern von einem Tyrosin (Y118). E89 hingegen scheint im Mittelpunkt eines weitläufigen Wasserstoffbrückennetzwerks im aktiven Zentrum zu stehen, das möglicherweise entscheidend zur Stabilität des Enzyms beiträgt und so die im Vergleich zur AaSOR geringere Anzahl an internen Salzbrücken kompensiert. Die bislang postulierten Substrat- und Produktrouten innerhalb des Enzyms wurden durch softwaregestützte Analysen in der neuen HnSOR- Kristallstruktur überprüft. Der bislang als Ausgang aus dem Enzym angesehene Trimerkanal kann aufgrund eines zu geringen Durchmessers und mangelnder Flexibilität der beteiligten Aminosäuren nicht als solcher fungieren. Zwei neu identifizierte Verbindungen mit der Enzymoberfläche könnten jedoch diese Funktion übernehmen. Die vermuteten Verbindungen zwischen aktivem Zentrum und der inneren Kavität der SOR über eine Eingangs- und eine Ausgangspore wurden dagegen bestätigt. Zudem wurde eine dritte Pore zum aktiven Zentrum beobachtet, die am essentiellen CSS33 lokalisiert ist und deren Öffnungszustand von der Konformation der Aminosäure M303 abhängt. Bei der AaSOR weisen hingegen Mutations- und Porenanalysen darauf hin, dass das aktive Zentrum dieser SOR lediglich durch eine einzige Pore mit der inneren Kavität verbunden ist.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The sulfur oxygenase reductase (SOR) is the initial enzyme of the sulfur oxidation pathway in the acidophilic and chemolithoautotrophic archaeon Acidianus ambivalens (AaSOR). The enzyme catalyzes an oxygen-dependent disproportionation of elemental sulfur with sulfite, thiosulfate and hydrogen sulfide as detectable products. The exact reaction mechanism of this disproportionation reaction is unknown. The previously known temperature range of the AaSOR was 50 to 108 °C. Optimization of the SOR activity assay and associated detection reactions showed that the AaSOR is also active at low temperatures down to 10 °C. Thus, an activity of a SOR below 50 °C cannot be regarded as special adaption to mesophilic habitats any longer. Furthermore, it was shown that thiosulfate is not a primary product of the SOR. It is solely formed by a chemical non-enzymatic reaction of sulfite and elemental sulfur at elevated temperatures. The active site of the AaSOR comprises three highly conserved cysteines (C31, C101 and C104) of which C31 is persulfurated (CSS31). As CSS31 is essential for enzyme activity, it is expected to be the substrate-binding site. In order to verify this hypothesis, organic sulfur-containing molecules were sought that act as substrate analogues and have an inhibitory effect on the SOR. The oligo sulfides diallyl trisulfide, dimethyl disulfide, di-tert-butyl-polysulfide and artificial garlic oil matched these specifications. X-ray crystallography was performed to identify the binding sites of these inhibitors. The crystal structures showed modifications of all three conserved cysteines without a specific modification of any single amino acid in the active site. Thus, it was not possible to verify CSS31 as substrate-binding site. Beside the three cysteine residues, the active site of the SOR includes a mononuclear iron atom, which is coordinated by a 2-His-1-carboxylate facial triad and two water molecules. The secondary coordination sphere is built by E87 that is linked to H86 by a hydrogen bond. The substitution of E87 by alanine resulted in a decrease of activity down to 26 %, whereas an E87D mutant showed wild type-like activity. The secondary coordination sphere affects the iron site and enzymatic activity by hydrogen bonding. Previous EPR experiments demonstrated a redox change from Fe3+ to Fe2+ upon incubation with sulfur at high temperatures. The active-site iron of the SOR was replaced by high purity cobalt, gallium, manganese and nickel to check, whether the redox change is essential for SOR catalysis. All SOR derivatives were biochemically active. The Co- and Mn-SORs showed the characteristic EPR signals for Co2+ and Mn2+ species, respectively. These signals remained after incubation with elemental sulfur at high temperatures showing that the oxidation states of the metal ions remained unchanged during catalysis. This suggests that no redox change of the metal center is necessary for dioxygen activation. The analysis of the corresponding crystal structures gave no novel insights into structural differences between the active sites of the SOR derivatives. X-ray fluorescence spectroscopy and data obtained by anomalous scattering showed that the metal centers were occupied by the introduced substitution metals but also by unwanted metal ions. ICP-MS analysis of SOR derivatives prepared under high purity conditions verified that the detected contaminations were introduced during crystallization or crystal preparation. An initial structural characterization of the SOR of the mesophilic gammaproteobacterium Halothiobacillus neapolitanus (HnSOR) was started in a previous dissertation. Here, the characterization was continued and a crystal structure with 2.1 Å resolution was obtained. HnSOR and AaSOR share a high similarity in protein architecture and the active site structure. Beside the already known persulfuration of C33, an additional sulfur atom was observed at each of C103 and C106. C103 and C106 even appeared to be linked by a tetra sulfide bridge. As in the AaSOR, three amino acids (H88, H92 und E116) and two water molecules coordinate the mononuclear iron. The secondary coordination sphere does not consist of the E87-homologous residue E89 but of a tyrosine (Y118). However, E89 seems to be in the center of an extensive hydrogen bond network, which could significantly contribute to enzyme stability and compensate the smaller number of internal salt bridges compared to the AaSOR. The postulated substrate and product pathways within the enzyme were examined in the new HnSOR crystal structure by software-aided analysis. The expected connections between the active site and the inner cavity of the SOR via an entry and an exit pore were confirmed. The trimer channel, so far expected to be a pathway of the products out of the enzyme, was found to be too limited in diameter to function as an exit pore, especially since the associated amino acids add a low flexibility. Two newly identified connections between the inner cavity and the surface of the enzyme could adopt this function. Moreover a third pore to the active site was observed, which is located next to the essential CSS33. The opening state of this pore depends on the conformation of M303. These results point to differences between the HnSOR and AaSOR, since mutagenesis and structural analyses indicated that a single pore connects the active site and the inner cavity of this SOR.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Sulfur Biochemistry and Microbial Bioenergetics
Date Deposited: 12 Jul 2017 12:20
Last Modified: 12 Jul 2017 12:20
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-65786
Referees: Kletzin, PD Dr. Arnulf and Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 4 November 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/6578
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