| Abstract: |
Anionenkanäle sind in den Membranen aller Eukaryonten vorhanden und wichtig für viele physiologische Prozesse. Pflanzliche Anionenkanäle wurden in den vergangenen Jahren intensiv mit elektrophysiologischen Methoden untersucht, über die molekularen Eigenschaften der pflanzlichen Anionenkanäle ist jedoch nach wie vor sehr wenig bekannt. Der Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag deshalb in der Untersuchung, ob ein Homolog zu den tierischen “Chloride Intracellular Channels“ (CLICs), das pflanzliche Protein AtCLIC, als Anionenkanal funktionieren kann. Um diese Fragestellung zu bearbeiten, wurden insbesondere spezielle elektrophysiologische, proteinbiochemische und mikroskopische Methoden angewendet. Die wesentlichen Ergebnisse aus diesen Untersuchungen können wie folgt zusammengefasst werden: Es konnte aufgezeigt werden, dass im Genom von Arabidopsis thaliana ein Protein codiert ist, das eine grosse Ähnlichkeit mit dem intrazellulären Chloridkanal CLIC1 aus Homo sapiens aufweist. Dieses Protein, im folgenden AtCLIC genannt, gehört zur Klasse der Dehydroascorbat-Reduktasen (DHARs) aus der Familie pflanzlicher Gluthathion-S-Transferasen (GSTs). AtCLIC zeigt jedoch deutlich höhere Sequenzidentitäten zu Vertretern der tierischen CLIC-Familie, als zu den pflanzlichen GSTs aus A. thaliana. Vergleiche der Phylogenie gaben einen Hinweis darauf, dass beide Familien, die der GSTs und der CLICs, einen gemeinsamen Vorfahren haben könnten. Weiterhin wurde mit Hilfe der "Patch-Clamp-Technik" nachgewiesen, dass das Protein AtCLIC in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293) und Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO-K1) eine einwärtsgleichrichtende Leitfähigkeit mit geringer Chloridselektivität induziert. Bei Inhibierungsexperimenten wurde deutlich, dass der untersuchte Kanal sensitiv auf den Anionenkanal-Inhibitor IAA-94 reagiert. Mittels Lokalisationsstudien durch confokale Laserscanning Mikroskopie wurde mit Hilfe des Fusionsproteins AtCLIC::GFP die Verteilung von AtCLIC im heterologen System HEK293-Zelle untersucht. Dabei wurde die Vermutung bestätigt, dass sich das Protein sowohl gelöst im Cytosol als auch in der Plasmamembran aufhält. Dies zeigte sich besonders an hoch membranösen Zellstrukturen, den Filopodien. Durch Colokalisation mit dem Membranfarbstoff Fm4-64 konnte eine Membranlokalisation des Proteins AtCLIC bestätigt werden. Auch bei einer proteinbiochemischen Lokalisationsstudie wurde das Fusionsprotein AtCLIC::GFP sowohl im Cytosol als auch in der Membran der Zellen nachgewiesen. Das pflanzliche Protein AtCLIC aus A. thaliana ist also strukturell nah mit dem tierischen Anionenkanal CLIC1 verwandt und induziert eine erhöhte Membranleitfähigkeit, wenn es in einer Zelle exprimiert wird. Die Ergebnisse aus den vorliegenden Untersuchungen und Experimenten legen die Vermutung nahe, dass das pflanzliche Protein AtCLIC ein Kanal ist, der ein Anionenkanal am Tonoplasten von Pflanzen sein kann. |
| Alternative Abstract: |
| Alternative Abstract | Language |
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Anion channels are present in the membranes of all eukaryotes; they are important for many physiological processes. During the past years anion channels of plants have been extensively examined with electrophysiological techniques. However, still very little is known about the molecular identity of these channels. The main focus of the present work was therefore to investigation, whether the plant protein AtCLIC, a homolog to the animal "Chloride Intracellular Channels" (CLICs), can function as an anion channel. To address this question a combination of electro-physiological, protein-biochemical and microscopical methods were applied. The essential results of these investigations can be summarized as follows: It was found that the genome of Arabidopsis thaliana encodes a protein with appreciable resemblance to the intracellular chloride channel CLIC1 from Homo sapiens. This protein, here called AtCLIC, belongs to the class of dehydroascorbate reductases (DHARs) from the family of plant glutathione transferases (GSTs). Nevertheless, AtCLIC shows a higher sequence identity to representatives of the animal CLIC family, than to other plant GSTs from A. thaliana. Phylogenetic comparison suggests that both families, the GSTs and the CLICs, may have a common ancestor. Furthermore "patch clamp " experiments revealed that the protein AtCLIC induces an inward rectifing conductance with low chloride selectivity, when expressed in human embryonic kidney cells (HEK293) and chinese hamster ovary cells (CHO-K1). Pharmacological experiments were showing that the CLIC mediated conductance was sensitive to the anion channel inhibitor IAA-94. The localisation of the fusion protein AtCLIC::GFP in the heterologous system HEK293-cell was examined by confocal laserscanning microscopy. The assumption that the protein is located in the cytosol as well as in the plasma membrane was confirmed. Membrane localization could be demonstrated especially in highly membranous filopodia. A membrane localisation of the protein AtCLIC could be further confirmed by colocalisation with the membrane dye Fm4-64. Also a protein-biochemical approach implied that the fusion protein AtCLIC::GFP was present in the cytosol as well as in the membrane of the cells. The structural resemblance of AtCLIC from A thaliana with the animal chloride channel CLIC1, the membrane localization and the fact that the plant protein induces a distinct membrane conductance suggests that AtCLIC can function as ion channel. | English |
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