Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) sind Effektor-Lymphozyten des angeborenen Immunsystems. Sie zeichnen sich besonders durch die Fähigkeit aus, eine Vielzahl von Tumor- und Virus-infizierten Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Aus diesem Grund spielen sie eine wichtige Rolle bei der Eindämmung pathophysiologischer Prozesse. Ein Verständnis der molekularen Vorgänge, die zur NK-Zell-Aktivierung führen, ist wichtig für die Verbesserung der Effektivität von NK-Zell-basierten Krebstherapien. Die Erkennung von Zielzellen durch NK-Zellen wird über spezifische Oberflächenrezeptoren vermittelt, wobei die Aktivität der NK-Zellen durch antagonistisch wirkende aktivierende und inhibierende Signale reguliert wird. Einer der wichtigsten aktivierenden NK-Zell-Rezeptoren ist NKp30, welcher zu den Natürlichen Zytotoxizitäts-Rezeptoren (natural cytotoxicity receptors, NCRs) gehört. NKp30 ist sowohl in Menschen und Primaten (Makaken und Schimpansen) als auch auf bestimmten NK-Zell-Untergruppen in der Ratte ein funktionaler Rezeptor. Im Gegensatz dazu ist es in der Maus nur als Pseudogen mit zwei vorzeitigen Stop-Codons vorhanden. Die einzige Ausnahme ist der Maus-Stamm Mus caroli, in dem zwei Einzelnukleotid-Polymorphismen (single nucleotide polymorphisms, SNPs) die vorzeitigen Stop-Codons eliminieren. Die Gründe für die Entwicklung des NKp30 Pseudogens in der Maus sind derzeit unbekannt. Für die Signalweiterleitung assoziiert NKp30 mit Adapter-Proteinen die intrazelluläre Immunrezeptor-Tyrosin-basierte Aktivierungsmotive (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs) tragen (CD3ζ und FcεRIγ). Bisher sind die Ligandenbindung und die nachfolgende Rezeptor-Aktivierung, sowohl im Hinblick auf die Art der Liganden als auch auf die initialen Schritte der Signalweiterleitung an das Adapter-Protein, unzureichend verstanden. Daher sollten diese molekularen Mechanismen, sowie die Rolle des NKp30 Pseudogens in der Maus in der vorliegenden Arbeit genauer untersucht werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Stalk-Domäne von NKp30, ein 15 Aminosäuren langer Sequenzbereich zwischen der Immunglobulin (Ig) Domäne und der Transmembran-Domäne, wichtig für die Liganden-Bindung und die Signalweiterleitung ist. Deshalb wurden in der vorliegenden Arbeit mutierte Varianten des NKp30 Rezeptors als Volllängen-Proteine in A5-GFP Reporterzellen und als NKp30::hIgG1-Fc (NKp30-Fc) Fusionsproteine in HEK 293T/17 Zellen produziert und auf ihre Fähigkeit zur Liganden-Bindung (Oberflächenplasmonresonanz [surface plasmon resonance, SPR] Experimente) und Signalweiterleitung (Reporterassays) untersucht. Überraschenderweise zeigten Analysen von NKp30/NKp46 Tandem Mutanten, dass die Stalk Domänen beider Rezeptoren, trotz der Existenz eines konservierten Sequenz-Motivs in der Membran-nahen Region, ohne drastische Beeinträchtigungen von Faltung, Plasmamembran-Targeting und/oder Liganden-induzierter Signalweiterleitung nicht austauschbar sind. Zusätzlich zeigte sich, dass Änderungen der Aminosäure Sequenz der Stalk Domäne starke Auswirkungen auf die Funktionalität des Rezeptors haben, da ein Aminosäure Austausch durch Alanin an jeder Stelle der Stalk Domäne zu einer Beeinträchtigung der Liganden-Bindung und/oder der Fähigkeit zur Signalweiterleitung führte. Die gravierendsten Auswirkungen hatte die Mutation von Arginin zu Alanin an Aminosäure Position 143 (R143A). Basierend auf den Ergebnissen weiterer Mutationsstudien, N-Glykosylierungskartierung (N-glycosylation mapping) und Ko-Expressionsstudien in HeLa Zellen kann die Existenz von zwei unterschiedlichen Typen von NKp30/CD3ζ Komplexen postuliert werden: (1) ein nicht zur Signalweiterleitung fähiger, struktureller NKp30/CD3ζ Komplex und (2) ein durch Liganden-Bindung induzierter, zur Signalweiterleitung fähiger NKp30/CD3ζ Komplex. Des Weiteren kann angenommen werden, dass die Liganden-Bindung an der Immunglobulin (Ig)-Domäne von NKp30 zu einer Translokation der Stalk-Aminosäure R143 von der Grenzfläche zwischen Membran und extrazellulärer Region zu einer tiefer in der Lipid-Doppelschicht liegenden Position führt. Dies ermöglicht eine Interaktion zwischen R143 und den entgegengesetzt geladenen Aspartat-Resten des CD3ζ-Proteins und damit die Aktivierung der Signalweiterleitung durch CD3ζ. Obwohl in den letzten Jahren mehrere zelluläre und Pathogen-assoziierte NKp30-Liganden identifiziert wurden, ist die Existenz weiterer, bisher unbekannter zellulärer Liganden möglich. Diese Annahme basiert auf der Tatsache, dass frühere Studien die Bindung von NKp30-Fc Fusionsproteinen an Krebs-Zelllinien zeigten, die keinen der beiden bekannten zellulären NKp30-Liganden (B7-H6 und BAG 6) auf ihrer Oberfläche trugen. Auf Grund dessen sollte in der vorliegenden Arbeit die Existenz weiterer Protein-Liganden genauer untersucht werden. Hierfür wurde eine Screening-Methode etabliert, welche auf der Transduktion von Liganden-tragenden Zelllinien mit einer genom-weiten shRNA Bibliothek basiert. Nach dem knockdown der putativen Liganden durch die shRNAs wurden die Zellen mit NKp30-Fc Fusionsproteinen dekoriert und Zellen mit reduzierter NKp30-Liganden-Expression mittels Fluoreszenz-aktivierter Zell-Sortierung (fluorescence activated cell sorting, FACS) angereichert. Die shRNA Sequenzen wurden anschließend durch PCR aus der genomischen DNA der angereicherten Zellen amplifiziert und mittels Deep sequencing analysiert. Die selbe Screening Methode wurde auch zur Identifizierung von Liganden für die anderen beiden NCRs NKp44 und NKp46 eingesetzt. Interessanterweise konnten trotz diverser Vorteile dieser Screening Methode keine weiteren zellulären Protein-Liganden für die NCRs identifiziert werden. Über das evolutionäre Auftreten der NCRs gibt es unterschiedliche Ansichten. Die Entwicklung aus einem gemeinsamen NCR-Vorläufer-Gen (zumindest im Fall von NKp30 und NKp44) könnte zu einer Erhöhung der Komplexität und Spezialisierung einzelner Komponenten des Immunsystems geführt haben. Studien halten sowohl die Entwicklung des NKp46 Gens aus einem gemeinsamen NCR-Vorläufer als auch aus einem gemeinsamen Vorläufer mit den KIR Genen für möglich. Interessanterweise ist murines NKp46 ein funktionales Protein, während NKp30 nur als Pseudogen und NKp44 gar nicht in der Maus vorkommt. Um die evolutionären Gründe zu verstehen, die zur Entwicklung des murinen NKp30 (mNKp30) Pseudogens führten, wurden die zwei vorzeitigen Stop-Codons in der extrazellulären Domäne der M. musculus Gen-Sequenz repariert und das Protein als Volllängen-Rezeptor in A5-GFP Zellen sowie als mNKp30-Fc Fusionsprotein in HEK 293T/17 Zellen produziert. Interessanterweise wurden sowohl der Volllängen-Rezeptor als auch das mNKp30-Fc Fusionsprotein intrazellulär zurückgehalten. Eine Reparatur der drei fehlenden N-Glykosylierungsstellen in der extrazellulären Region von mNKp30 (mNKp30-glyco) führte zur Sekretion des Fc-Fusionsproteins, während der Volllängen-Rezeptor weiterhin intrazellulär zurückgehalten wurde. Wie in vorherigen Studien und auch in der vorliegenden Arbeit gezeigt wurde, beeinflusst die Assoziation mit CD3ζ die Verweilzeit des humanen NKp30 Rezeptors auf der Plasmamembran (Targeting und Retention). Daher kann die intrazelluläre Lokalisation des mNKp30 Proteins möglicherweise dadurch erklärt werden, dass der Rezeptor nicht in der Lage ist mit CD3ζ zu assoziieren. Des Weiteren zeigte das mNKp30-glyco-Fc Fusionsprotein eine spezifische Bindung an P815 Maus Mastozytom Zellen. Dies spricht für die Existenz eines Tumor- oder Mastzell-spezifischen mNKp30-glyco Liganden. Insgesamt waren dies die ersten Experimente zur Expression und Funktionsanalyse eines putativen mNKp30 Rezeptors auf Protein-Ebene. Basierend auf diesen Daten liefert die vorliegende Arbeit tiefere Einblicke in die Funktion des aktivierenden NK Zell-Rezeptors NKp30. Dies trägt zu einem besseren Verständnis der molekularen Mechanismen bei, die zur Aktivierung von NK Zellen führen. Dieses Wissen ist wichtig für die zukünftige Entwicklung und Verbesserung von NK-Zell-basierten antiviralen und Krebs-Therapien.