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Epigenetische und molekulargenetische Untersuchungen zur Beteiligung von RNA-bindenden Proteinen an der RNA-Editing-Reaktion in afrikanischen Trypanosomen

Fuss, Anne :
Epigenetische und molekulargenetische Untersuchungen zur Beteiligung von RNA-bindenden Proteinen an der RNA-Editing-Reaktion in afrikanischen Trypanosomen.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2005)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Epigenetische und molekulargenetische Untersuchungen zur Beteiligung von RNA-bindenden Proteinen an der RNA-Editing-Reaktion in afrikanischen Trypanosomen
Language: German
Abstract:

RNA-bindende Proteine sind als Komponenten von Ribonukleoproteinkomplexen auf allen Ebenen genetischer Regulation von Bedeutung. In dieser Arbeit wurde die Beteiligung RNA-bindender Proteine an der RNA-Editing-Reaktion in afrikanischen Trypanosomen untersucht. Im Fokus der Studie stehen die beiden mitochondrialen Polypeptide gBP21 und TbRGG1 aus dem Rinderpathogen Trypanosoma brucei. Unter Verwendung epigenetischer „knockdown” Mutanten wurde die Beteiligung der Proteine in vivo und in vitro untersucht. Fortführend wurde in molekulargenetischen Experimenten die gRNA/gBP21 Wechselwirkung und die Bindung von gBP21 an den RNA-Editingkomplex analysiert. RNA-Bindestudien mit unterschiedlichen, durch in vitro Mutagenese generierten, gBP21-Mutanten erlaubten es die gRNA-bindenden Proteindomänen von gBP21 zu identifizieren. Durch Affinitätsaufreinigungen konnte gezeigt werden, dass zu Beginn eines Reaktionszyklus’ ein editingaktiver Komplex vorliegt. Die erzielten Ergebnisse sind nachfolgend zusammengefasst: (1) Das RNA-bindende Protein TbRGG1 ist eine essentielle Komponente des RNA-Editingkomplexes. Eine epigenetische TbRGG1-Mutante von T. brucei zeigt sowohl in vitro als auch in vivo reduzierte RNA-Editingaktivität. (2) Das gRNA-bindende Protein gBP21 ist an der RNA-Editing-Reaktion beteiligt, jedoch keine essentielle Komplexkomponente. Das Fehlen des Proteins in Folge der spezifischen Transkriptdegradation durch RNA-Interfernz führt in vivo zu pleitropen Effekten, die sowohl editierte als auch nicht editierte mitochondriale Transkripte involvieren. (3) An der gRNA-Bindung von gBP21 sind die argininreichen Sequenzmotive (Rbox) des Proteins beteiligt. Mutationen der Rbox1 und/oder Rbox2 eliminieren die RNA-Bindefähigkeit von gBP21. Die Rbox3 ist an der Bindung beteiligt, allerdings nicht essentiell. Ebenso führt die Deletion der Aminosäuren 133-157 zum Verlust der RNA-Interaktion. (4) Affinitätsgereinigte, gBP21-enthaltende Komplexe besitzen RNA-Editingaktivität. gBP21 ist somit Teil des aktiven RNA-Editing-Komplexes und dissoziiert nicht nach der Formation des binären gRNA/prä-mRNA Hybrids vom Komplex ab. Der Editingkomplex ist vielmehr zum Zeitpunkt der Hybridisierung soweit assembliert, dass alle enzymatisch notwendigen Komponenten enthalten sind.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
RNA-binding proteins as components of ribonucleoprotein complexes contribute to all levels of gene regulatory processes. The present study is focused on the involvement of RNA-binding proteins in the RNA editing reaction in African trypanosomes. Two mitochondrial RNA-binding proteins, termed gBP21 and TbRGG1, from the parasitic cattle pathogen Trypanosoma brucei were analyzed. The participation of the two polypeptides was investigated in vivo and in vitro by using epigenetic gBP21- and TbRGG1-knockdown trypanosomes. The gRNA/gBP21 interaction and the binding of gBP21 to the RNA editing complex were investigated by molecular genetic experiments. RNA binding studies with gBP21 mutant proteins allowed the identification of the RNA-binding domain of the polypeptide. Affinity purification experiments demonstrated that fully active editing complexes are already assembled at the start of an RNA editing cycle. The following results can be summarized: (1) The RNA-binding protein TbRGG1 is an essential component of the RNA editing complex. An epigenetic TbRGG1-mutant of T. brucei shows reduced RNA editing activity in vitro and in vivo. (2) The gRNA-binding protein gBP21 contributes to the RNA editing reaction but is not an essential component of the complex. RNAi-induced, gBP21-minus trypanosomes show a pleiotropic in vivo effect: Edited and non-edited mitochondrial transcripts are affected. (3) All three Arginine-rich sequence boxes (Rbox) of gBP21 contribute to the gRNA-binding domain of the protein. Mutations within Rbox1 and/or Rbox2 eliminate the ability of gBP21 to bind to gRNAs. Rbox3 is involved in the gRNA binding reaction, but is not essential. Likewise, deletion of amino acids 133 to 157 abolishes RNA binding. (4) Affinity-purified gBP21-containing RNA editing complexes are competent to perform the RNA editing reaction in vitro. Thus, gBP21 is part of active RNA editing particles and does not dissociate from the complex after the formation of the binary gRNA/pre-mRNA hybrid. At the time of the RNA/RNA hybridization the editing complex is fully assembled and enzymatic competent.English
Uncontrolled Keywords: RNA-Protein-Wechselwirkung, gBP21, TbRGG1, RNA-bindende Proteine
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
RNA-Protein-Wechselwirkung, gBP21, TbRGG1, RNA-bindende ProteineGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:51
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000613
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-6135
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Göringer, Prof.Dr. Hans Ulrich and Pfeifer, Prof.Dr. Felicitas
Advisors: Göringer, Prof.Dr. Hans Ulrich
Refereed: 1 August 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/613
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