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Establishment of a good manufacturing practice-compliant procedure for expansion of therapeutic doses of genetically modified, CAR expressing NK-92 cells for the treatment of ErbB2-positive malignancies

Nowakowska, Paulina :
Establishment of a good manufacturing practice-compliant procedure for expansion of therapeutic doses of genetically modified, CAR expressing NK-92 cells for the treatment of ErbB2-positive malignancies.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

Doktorarbeit Nowakowska Paulina .pdf
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Establishment of a good manufacturing practice-compliant procedure for expansion of therapeutic doses of genetically modified, CAR expressing NK-92 cells for the treatment of ErbB2-positive malignancies
Language: English

The NK-92/5.28.z cell line is an ErbB2 (HER2) specific, CAR-expressing continuously growing derivative of the clinically applicable NK-92 line, and exhibits profound and highly specific cytotoxicity against ErbB2-expressing tumor targets which are resistant to parental NK-92 cells. This study aimed to establish good manufacturing practice procedures enabling the generation of therapeutic doses of ErbB2-CAR expressing NK-92 cells for upcoming phase I/II clinical trials in ErbB2-overexpressing malignancies. The concept of patient dose manufacturing presented here encompasses the generation of a GMP-compliant master cell bank, which serves as a well-defined source of NK-92/5.28.z cells for further expansion of individual patient doses. To reach sufficient numbers of genetically modified NK-92 cells, expansion protocols were developed by systematic testing of culture conditions including GMP-grade culture media (X-Vivo 10 with human holo-transferrin, X-Vivo 10 with recombinant transferrin, CellGro) and human serum substitutes (human serum albumin, platelet lysate, heat inactivated human plasma). Since growth and potency of NK-92/5.28.z cells are IL-2 dependent, identification of a suitable concentration of this cytokine was an important issue addressed in this work. As a result of performed analyses, X-Vivo 10 containing recombinant transferrin supplemented with 5 % of heat inactivated human plasma and 500 U/ml IL-2 was selected as the culture medium for clinical expansions. This combination supported reproducible cell growth with doubling time of 28.84 h ± 0.5 h ±, maximal -fold expansion in batch culture of 24.97 ± 0.65 (max. conc.: 12.49 x 105 ± 0.32 x 105 cells/ml ) stable CAR expression and potency of the cells, even in long-term culture (CAR expression: 99.77 % ± 0.03 %; specific cytotoxicity: 89.75 % ± 3.77 % after 12 months of culturing). Considering the sensitivity of NK-92 and its CAR-expressing derivative to cryopreservation procedures, a part of this thesis focused on selection of cryopreservation solutions providing satisfactory post-thaw recovery of frozen cells, where human serum albumin as a base medium supplemented with 7.5 % DMSO gave the best results (post-thaw recovery of NK-92/5.28.z cells: 68.84 % ± 5.07 %). Following established GMP-compliant culture and cryopreservation procedures, a master cell bank comprising 200 vials of NK-92/5.28.z cells was generated. By means of concurrently developed quality control methods, 6 representative vials from the master cell bank were tested in terms of manufacturing related parameters (mean cryovial content, post-thaw recovery and cell growth, cell identity, specific cytotoxicity) confirming the high quality of the cells and thereby the validity of the performed process. Multiparameter analysis revealed that therapeutic doses of 5 x 109 NK-92/5.28.z cells can be expanded from a master cell bank within 5 days. Application of X-Vivo 10 rTF medium supplemented with 100 U/ml of IL-2 as an excipient, supported 6-hour shelf life of irradiated (10 Gy) NK-92/5.28.z cells formulated as a final product at the density of 5 x 107/ml. This concentration translates to the final dosage form of 1 x 108 cells/dose in 2 ml, a volume which is suitable for intracranial injection in the upcoming clinical trial in glioblastoma. The systemic (intravenous) route of administration planned in an upcoming breast cancer trial will allow the infusion of even higher volumes of up to 100 ml, and thereby higher cell numbers up to 5 x 109 cells/dose. In addition, investigation of factors impacting the efficacy and safety of clinical application was another important part of this thesis. Analysis of soluble factors released by target stimulated NK-92/5.28.z cells showed selective and significant increase in the secretion of GZMB (2-fold), IFN-γ (4-fold), IL-8 (24-fold) and IL-10 (5-fold) NK-92/5.28.z upon stimulation with ErbB2(+) targets. This phenomenon was not observed in the case of parental NK-92 cells and primary NK cells, indicating resistance of ErbB2(+) target cell line to natural killing mechanism, which can be overcome by specific CAR-mediated activation. Abundant amounts of immunomodulatory cytokines secreted by tumor activated NK-92/5.28.z may stimulate the host immune system by interaction with dendritic cells, induction of CTL and tumor-specific antibody production by B cells. Of possible relevance for clinical tolerability, IL-6 which plays the leading role in cytokine release syndrome was not detected. Treatment with clinically relevant doses of corticosteroids (maximal dose of 200 µg/ml corresponds with the highest dose of prednisolone applied clinically) did not affect retargeted killing of ErbB2(+) targets by NK-92/5.28.z cells, while natural killing against K562 cells was attenuated in a dose-dependent manner, as expected. Colony forming assays with mobilized peripheral blood progenitor cells pretreated with NK-92 or NK-92/5.28.z showed no evidence of NK cell impact on the colony forming capacity of PBSCs. In this study, GMP-compliant procedure enabling production of therapeutic doses of NK-92/5.28.z was successfully established. The data identify genetically modified, CAR-expressing NK-92 cells as a powerful, clinically feasible candidate for efficient and safe adoptive immunotherapy of ErbB2-overexpressing malignancies like breast cancer or glioblastoma.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Die NK-92/5.28.z-Zelllinie ist unter optimalen Zellkulturbedingungen eine kontinuierlich wachsende, ErbB2 (Her2) Tumorantigen spezifische CAR-exprimierende Variante der klinisch einsetzbaren NK-92-Zellen. Sie zeichnet sich durch ihre hohe Zytotoxizität gegenüber ErbB2-positiven Tumorzellen aus, die gegen parentale NK-92-Zellen resistent sind. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung von GMP-konformen Protokollen zur Herstellung von therapeutischen Dosen ErbB2-CAR-exprimierender NK-92/5.28.z-Zellen für bevorstehende klinische Phase I/II Studien zur Therapie ErbB2-überexprimierender Tumore. Das in dieser Arbeit vorgestellte Konzept zur Herstellung therapeutischer Dosen schließt die Erstellung einer GMP-konformen Masterzellbank ein, die als qualifizierte Ausgangsbasis für die Herstellung von individuellen Patientendosen der NK-92/5.28.z-Zelllinie dienen soll. Um eine ausreichende Anzahl genetisch modifizierter NK-92/5.28.z-Zellen zu erhalten, wurden optimale Expansionsprotokolle entwickelt, indem systematisch die Kulturbedingungen getestet wurden. Insbesondere wurde die Eignung verschiedener Zellkulturmedien (X-Vivo 10 mit humanem holo-Transferrin, X-Vivo 10 mit rekombinantem Transferrin (rTF), CellGro) sowie humaner Serumsubstitute (humanes Serumalbumin, humanes Plättchenlysat, hitzeinaktiviertes humanes Plasma) hinsichtlich einer GMP-konformen Zellexpansion untersucht. Da Zellproliferation und Funktionalität von NK 92/5.28.z-Zellen IL-2-abhängig sind, war die Findung einer optimalen Konzentration dieses Zytokins ein wichtiger Aspekt dieser Arbeit. Es zeigte sich, dass das Zellkulturmedium X Vivo 10 mit rTF, supplementiert mit 5% hitzeinaktiviertem humanem Plasma und 500 IU/ml rekombinantem IL-2, ein reproduzierbares Zellwachstum und gleichbleibende Funktionalität mit stabilen Zelldopplungszeiten (28,84 h ± 0,50 h), einer 24,97 ± 0,65 –fachen maximalen Expansion (max. Zellkonzentration: 12,49 x 105 ± 0,32 x 105 Zellen/ml) sowie einer stabilen CAR-Expression und funktionellen Aktivität (CAR-Expression: 99.77 % ± 0.03 %; spezifische Zytotoxizität: 89.75 % ± 3.77 %) auch in einer Langzeitkultur bis 12 Monate garantiert. In Anbetracht der Empfindlichkeit von NK-92-Zellen und der davon abgeleiteten genetisch modifizierten Variante wurde ein besonderer Schwerpunkt auf die Optimierung der Kryokonservierungsmedien hinsichtlich der erzielbaren Zellausbeuten nach dem Auftauprozess gelegt. Hier zeigte sich 7,5% DMSO in humanem Serumalbumin als am besten geeignet (Rate vitaler NK-92/5.28.z-Zellen nach dem Auftauen: 68.84 % ± 5.07 %). Auf Basis dieser GMP-konformen Zellkultur und Kryokonservierung wurde eine Masterzellbank von NK-92/5.28.z-Zellen mit 200 Ampullen angelegt. Entsprechend der entwickelten Qualitätskontrollprotokolle konnte bei allen 6 repräsentativ untersuchten Ampullen der Masterzellbank die Einhaltung von herstellungsrelevanten Aspekten, wie Gesamtzellzahl, Zellkonzentration, Zellausbeute nach dem Auftauen, Zellwachstum, Zellidentität und spezifische Zytotoxizität bestätigt werden. Anschließend wurden Faktoren untersucht, die hinsichtlich der Herstellung einer Patientendosis essentiell sind. Dies umfasste Transportbedingungen, Injektionsmedium, Bestrahlungsdosis und die maximale Zellkonzentration des finalen Produktes. Therapeutische Patientendosen von 5 x 109 NK-92/5.28.z-Zellen konnten innerhalb von 5 Tagen aus der Masterzellbank generiert werden. Die Verwendung von X-Vivo 10 rTF, supplementiert mit 100 IU/ml rekombinantem IL-2 als Exzipient erlaubte für die Formulierung des Endproduktes eine Zelldichte von 5 x 107/ml bestrahlter (10Gy) NK-92/5.28.z-Zellen und ermöglichte eine Haltbarkeit des Produktes von 6 Stunden. Zur intrakranialen Applikation der NK-92/5.28.z-Zellen in der geplanten Glioblastom-Studie können maximal 2 ml Zelldispersion verwendet werden, so dass als maximale finale Dosis 1 x 108 Zellen injiziert werden können. Die systemische Gabe in der geplanten klinischen Studie für Brustkrebspatienten ermöglicht die Injektion von bis zu 100 ml Zelldispersion, wodurch bei diesen Patienten bis zu 5 x 109 NK-92/5.28.z-Zellen pro Injektion appliziert werden können. Zusätzlich wurden weitere Faktoren untersucht, die wesentliche Auswirkungen auf die Effizienz und Sicherheit einer klinischen Anwendung von NK-92/5.28.z-Zellen haben. So konnte nach Zellkontakt mit Tumorantigen-exprimierenden Zielzellen mit NK-92/5.28.z-Zellen ein signifikanter Anstieg der Sekretion von Granzyme B (2-fach), IFN-γ (4-fach), IL-8 (24-fach) und IL-10 (5-fach) durch NK-92/5.28.z-Zellen bestimmt werden. Diese Sekretion war spezifisch für NK-92/5.28.z-Zellen und konnte sowohl für parentale NK-92-Zellen als auch für primäre NK-Zellen nicht beobachtet werden, was die Resistenz ErbB2(+)-Zielzellen gegenüber der natürlichen Zytotoxizität nahe legt. Große Mengen immunmodulatorischer Zytokine, die durch aktivierte NK-92/5.28.z-Zellen sekretiert werden, können durch Interaktionen mit dendritischen Zellen, Induktion von CTL und tumor-spezifischen Antikörper produzierenden B-Zellen Einfluss auf das Wirtsimmunsystem nehmen. IL-6, ein pro-inflammatorisches Zytokin, dem eine entscheidende Rolle beim sogenannten „cytokine-release syndrom“ zukommt, konnte nicht nachgewiesen werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass klinisch relevante Dosen von Kortikosteroiden (die maximale eingesetzte Dosis von 200 µg/ml entspricht der höchsten verabreichten Prednisolonmenge, die klinisch appliziert wird) keinen Einfluss auf die spezifische Zytotoxizität von NK-92/5.28.z-Zellen haben, während die natürliche Zytotxizität gegenüber K562-Zellen dosisabhängig inhibiert wurde. Schließlich konnte auch kein Einfluss der parentalen NK-92-Zellen sowie der NK-92/5.28.z-Zellen auf die Koloniebildungsfähigkeit von humanen peripheren Blutstammzellen in sogenannten CFU- (colony forming units) Assays nachgewiesen werden. In dieser Arbeit wurde ein GMP-konformer Prozess zur Herstellung therapeutischer Dosen von NK-92/5.28.z-Zellen erfolgreich etabliert und validiert. Die Ergebnisse demonstrieren, dass gegen das Tumorantigen ErbB2 gerichtete CAR-exprimierende NK-92-Zellen ein wirkungsvolles, klinisch anwendbares Therapeutikum für die Behandlung ErbB2-überexprimierender Tumore, wie Brustkrebs und Glioblastom, darstellt.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 13 Dec 2016 08:55
Last Modified: 13 Dec 2016 08:55
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-58557
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Bertl, Prof. Dr. Adam and Tonn, Prof. Dr. Torsten
Refereed: 18 November 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5855
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