TU Darmstadt / ULB / TUprints

Beeinflussung von Zellphysiologie und mitochondrialer Funktion durch Alzheimer Demenz-assoziiertes Amyloides-β Peptid

Decker, Victoria :
Beeinflussung von Zellphysiologie und mitochondrialer Funktion durch Alzheimer Demenz-assoziiertes Amyloides-β Peptid.
Technische Universität Darmstadt, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2016)

[img]
Preview
Text
Dissertation_Victoria Decker_2016_neues Deckblatt.pdf
Available under Only rights of use according to UrhG.

Download (39MB) | Preview
Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Beeinflussung von Zellphysiologie und mitochondrialer Funktion durch Alzheimer Demenz-assoziiertes Amyloides-β Peptid
Language: German
Abstract:

Bei Alzheimer Demenz (AD), der häufigsten Form der Demenzerkrankungen, gehen im Krankheitsverlauf durch langsam fortschreitende Neurodegeneration kognitive Funktionen unwiederbringlich verloren. Die Entwicklung von Präventionsmöglichkeiten sowie Therapien sind dringend erforderlich, weil die stetig wachsende Anzahl an Alzheimerpatienten mit erheblichen finanziellen und sozialen Belastungen für die Gesellschaft einhergehen. Die posttranslational aus dem amyloiden Vorläuferprotein APP, ein Typ I Transmembranprotein, generierten Aβ Peptide nehmen eine wichtige Funktion bei der AD Pathogenese ein. Jüngste Erkenntnisse benennen intraneuronal vorkommende Aβ Mono- und Oligomere als pathogene Formen des Peptids (Oligomer-Hypothese). Die Isoform Aβ1-42 scheint dabei am toxischsten zu sein. Von der Aβ Neurotoxizität sind vornehmlich Synapsen betroffen. Da die in den Synapsen konzentrierten Mitochondrien bereits in der sehr frühen Phase der AD Pathogenese Dysfunktionen aufweisen, fokussierte sich die vorliegende Studie auf Mitochondrien, um deren signifikante Funktion in der Anfangsphase der AD Pathogenese zu charakterisieren. Für die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen wurden die humane Neuroblastomzellline SH-SY5Y und die Ratten-Oligodendrozytenzelllinie OLN-93 mit 2,0 µM disaggregiertem Aβ1-42 Peptid für 24 h behandelt. Das extern applizierte Peptid wurde intrazellulär lokalisiert. Es wurden die Auswirkungen des Aβ1-42 Peptids auf die Zellviabilität, den oxidativen Stress, den Energiestoffwechsel, die mitochondrialen Mem¬branen sowie das Proteom analysiert. Aβ1-42 Peptide wurden mit Trifluoressigsäure disaggregiert, woraus Mono- bis Heptamere resultierten. Fluoreszenzmarkierte Aβ1-42 Peptide wurden nach 5 h Inkubation in späten Endo¬somen mittels Konfokalmikroskopie lokalisiert und nach 16 h in Mitochondrien. OLN-93 Zellen schienen eine größere Menge an Aβ1-42 Peptiden in die Mitochondrien aufzunehmen als SH-SY5Y Zellen. Aufgrund der Lokalisation in späten Endosomen nach kurzer Inkubationszeit wird postuliert, dass die Aufnahme der extern applizierten Peptide über Endozytose erfolgt. Auf die Zellviabilität von OLN-93 und SH-SY5Y Zellen, die mittels dem alamarBlue® Test und dem Neutralrot-Aufnahmetest im 96-well Format untersucht wurde, hatten Aβ1-42 Peptide keinen signifikanten Einfluss. Kennzeichen von frühapoptotischen Zellen ist die Verlagerung von Phosphatidylserin auf die extrazelluläre Seite der Plasmamembran, wo es von Annexin V gebunden werden kann. Propidiumiodid interkaliert in die DNA nach Verlust der Plasmamembranintegrität, charakteristisch für spätapoptotische bzw. nekrotische Zellen. Durchflusszytometrische Analysen nach FITC Annexin V- und Propidiumiodidzugabe zeigten in beiden Zelllinien keine Veränderung der Anzahl apoptotischer/nekrotischer Zellen durch Aβ1 42 Peptide. Das zellpermeable 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetat wird intrazellulär durch Esterasen gespalten und in Gegenwart von Wasserstoffperoxid durch Peroxidasen zum fluoreszierenden Dichlorfluorescein (DCF) oxidiert, wodurch es als Indikator für Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) gilt. In Aβ1-42 behandelten Proben wurde über die Messung der DCF-Fluoreszenz im 96-well Format eine große Zunahme (> 120%) der zellulären ROS Menge im Vergleich zu unbehandelten Proben gefunden. Aβ1-42 führt somit zu einer vermehrten Generierung von ROS und/oder zu einer Störung der Antioxidationssysteme. ROS induzieren u.a. Proteinoxidationen, die in Aktivitätsminderungen der betroffenen Proteine resultieren können. Mitochondriale Proteinoxidationen wurden über die Quantifizierung von OxyBlots(TM), die Proteincarbonylierungen detektieren, ermittelt. Aβ1-42 Behandlung resultierte in einem geringen Anstieg der mitochondrialen Proteincarbonylierung, der in Bezug zu bisherigen Untersuchungen der zellulären Proteincarbonylierung gebracht wurde. Der Einfluss von Aβ1-42 Peptiden auf den Energiestoffwechsels wurde durch die Analyse der spezifischen Aktivitäten von Atmungskettenkomplexen sowie der zellulären ATP Konzentration ermittelt. Die spezifischen Aktivitäten von NADH-Ubichinon-Oxidoreduktase (CI), Succinat Dehydrogenase (CII) und Cytochrom-c-Oxidase (CIV) wurden spektrophoto¬me-trisch an isolierten Mitochondrien (CI) bzw. Zelllysaten (CII und CIV) bestimmt. Die spezifische CI Aktivität verringerte sich in beiden Zelllinien durch Aβ1-42, wohingegen die spezifische CIV Aktivität zunahm. Aβ1-42 Peptide hatten keinen Einfluss auf die spezifische CII Aktivität in OLN-93 Zellen. In SH-SY5Y Zellen wurde eine Aβ1 42-vermittelte Abnahme der CII Aktivität beobachtet. Durch die Aktivitätsminderung an CI und CII könnten weitere ROS generiert werden. Die Aktivitätszunahme von CIV lässt sich durch eine gesteigerte Proteinmenge und/oder durch eine vermehrte Assemblierung zu Superkomplexen erklären. Die luminometrische Bestimmung der zellulären ATP Konzentration über die ATP-vermittelte oxidative Decarboxylierung von D-Luciferin durch Luciferase resultierte in einer Aβ1-42-ver-mittelten Verringerung der zellulären ATP Konzentration. Aβ1-42 Peptide führen demnach zu einer geringeren ATP Synthese und/oder zu einem größeren ATP Verbrauch. Die mitochondrialen Membranen wurden durch Aβ1-42 beeinflusst. Aβ1-42 Peptide führten zu einer Depolarisation des mitochondrialen Membranpotenzials (MMP), das über reduzierte MitoTracker® am Durchflusszytometer ermittelt wurde. Dieser Befund konnte durch die gemessene Aktivitätsminderung von CI erklärt werden. Aβ1-42-induzierte Kanäle in der Mitochondrienmembran könnten ebenfalls ursächlich für die Depolarisation des MMP sein. Anhand der steady-state Fluoreszenzanisotropie der Fluoreszenzsonde 1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatrien wurde eine Erhöhung der „Fluidität“ der Mitochondrienmembran bestimmt. Die Ergebnisse der Anisotropiemessungen stellen den Nachweis für die Interkalation des Aβ1-42 Peptids in die Mitochondrienmembran dar. Für Proteomanalysen wurden solubilisierte Proteine aus isolierten Mitochondrien in einer zweidimensionalen-blau-nativen/Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (2D-BN/SDS-PAGE) aufgetrennt und die Proteinuntereinheiten im Gel durch Peptidmassenfingerabdruck (PMF) mittels Matrix-Assisted Laser-Desorption Ionisation-Massenspektrometrie (MALDI-MS) identifiziert. Die Proteinmenge der Untereinheiten wurde anhand SYPRO® Ruby gefärbter 2D-Gele quantifiziert. Es wurden insgesamt 41 Proteine für OLN-93 identifiziert und 32 für SH-SY5Y. Der große Vorteil der eingesetzten 2D-BN/SDS-PAGE für die quantitative Proteomanalyse gegenüber der herkömmlichen Methode, die eine denaturierende isoelektrische Fokussierung in der 1. Dimension anwendet, ist die Möglichkeit der Auftrennung hydrophober Membranproteine sowie der Erhalt von Informationen über Protein-Protein-Interaktionen. 14% der quantifizierten Untereinheiten in OLN-93 Proben wurden durch Aβ1-42 signifikant beeinflusst. In OLN-93 Proben verringerten sich durch Aβ1-42 die Proteinmengen der α- und β-Untereinheiten der F1FO ATP Synthase (CV) in ihrem monomeren und dimeren Assemblierungszustand. Es wird daher davon ausgegangen, dass Aβ1-42 in einer Absenkung der ATP Synthese resultiert, die die gefundene Verringerung der ATP Konzentration in Aβ1-42-behandelten OLN-93 Zellen erklärt. Darüber hinaus wurden für die Pyruvatkinase und ein nicht identifiziertes Protein geringere Proteinmengen gefunden. In SH-SY5Y Proben zeigten 30% der quantifizierten Untereinheiten Aβ1-42-induzierte Veränderungen. Die Proteinmengen der α- und β-Untereinheiten von CV Dimer, der γ-Untereinheit von CV Monomer sowie der CII Untereinheit SDHA nahmen zu. Es wird postuliert, dass es sich dabei um Kompensationsmechanismen handelt, um Aktivitätsverluste, wie sie z.B. für CII im Rahmen der vorliegenden Arbeit gemessen wurden, auszugleichen. Die Proteinmengen von vier nicht identifizierten Proteinen erhöhten sich ebenfalls durch Aβ1-42. Die Hsp60 Menge nahm jedoch ab, wie auch die Proteinmengen von drei weiteren Proteinen, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht identifiziert werden konnten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden signifikante, Aβ1-42-induzierte Veränderungen der Zellphysiologie und der mitochondrialen Funktion gefunden. Diese Erkenntnisse können zur Entwicklung von Präventionsmöglichkeiten sowie Therapien beitragen, weil sie Informationen über die Anfangsphase der AD Pathogenese liefern.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Alzheimer's disease (AD) is the most abundant form of dementia. It is characterized by slowly progressing neurodegeneration resulting in irrecoverable loss of cognitive functions. The constantly rising number of AD patients leads to financial and social burden for society. Thus, the development of prevention options as well as therapies is of great importance. Aβ peptides play a crucial role in AD pathogenesis. They are generated from posttranslational processing of the amyloid precursor protein (APP), a type I transmembrane protein. Recent studies identified intracellular monomeric and oligomeric Aβ peptides as neurotoxic forms (oligomer hypothesis) whereof Aβ1-42 is the most pathogenic isoform. Synapses are mainly affected by Aβ neurotoxicity. It is known that mitochondria located in synapses exhibit dysfunctions already in the very early phase of AD pathogenesis. Hence, this study focused on mitochondria to characterize their significant functional alterations in the early phase of AD pathogenesis. The human neuroblastoma cell line SH-SY5Y and the rat oligodendroglia cell line OLN-93 were used as model systems in this study. Cells were incubated with 2.0 µM disaggregated Aβ1-42 peptides for 24 h. The externally applied peptides were located intracellular. Then effects of Aβ1-42 on cell physiology, oxidative stress, energy metabolism, mitochondrial membranes and proteome were analyzed. Disaggregation of Aβ1-42 peptides with trifluoroacetic acid resulted in monomers to heptamers. These peptides (labeled with fluorescent markers) were found in late endosomes after 5 h of incubation. After 16 h Aβ1-42 peptides were located in mitochondria. It appeared that mitochondria of OLN-93 cells incorporated higher amounts of Aβ1-42 peptides than SH-SY5Y cells. Due to the peptide's endosomal localization after a short incubation time it is postulated that its uptake is achieved by endocytosis. AlamarBlue® assay and neutral red uptake assay were used to determine cell viability which was not significantly affected upon Aβ1-42 treatment. Externalization of phosphatidylserine is characteristic of early apoptotic cells. Phosphatidylserine presented to the extracellular matrix is recognized by Annexin V. However, late apoptotic cells as well as necrotic cells lose integrity of plasma membrane enabling propidium iodide to intercalate into DNA. There was no Aβ1-42 induced change in the number of apoptotic/necrotic cells for both cell lines which was detected by flow cytometry analysis after treatment with FITC Annexin V and propidium iodide. Intracellular cleavage of the cell-permeant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate by esterases and oxidation by peroxidases in the presence of hydrogen peroxide results in the fluorescent 2',7'-dichlorofluorescein (DCF) that is used as a indicator for reactive oxygen species (ROS). Measuring the DCF fluorescence revealed a high increase (> 120%) in the cellular ROS amount in Aβ1-42 treated samples compared to untreated samples. Thus, Aβ1-42 leads to increased ROS generation and/or interference of ROS scavenging systems. ROS induce protein oxidation that may result in activity loss of affected proteins. Mitochondrial protein oxidation was determined by quantification of OxyBlots(TM) detecting protein carbonylation. Aβ1-42 treatment led to a slight increase of mitochondrial protein carbonylation that was interrelated to detections of cellular protein carbonylation by others. Determination of specific activities of enzymes involved in oxidative phosphorylation (OxPhos complexes) and cellular ATP concentration was used to investigate the influence of Aβ1-42 peptides on energy metabolism. Photometric measurements with isolated mitochondria or cell lysates were applied to determine specific activities of OxPhos complexes. Both cell lines showed decreased activity of NADH-ubiquinone oxidoreductase (CI) but increased activity of cytochrome c oxidase (CIV) upon Aβ1-42 treatment. Aβ1-42 peptides did not influence activity of succinate dehydrogenase (CII) in OLN-93 cells, but decreased CII activity was found in SH-SY5Y cells. Activity loss of CI and CII implies further ROS generation. Increase of CIV activity is explained by enhanced protein amount and/or increased supercomplex formation. Cellular ATP concentration was identified via luciferase catalyzed and ATP mediated oxidative decarboxylation of D-luciferin. Measuring the emerging luminescence revealed a decrease in the cellular ATP concentration in Aβ1-42 treated compared to untreated samples. Thus, Aβ1-42 peptides cause reduced ATP synthesis and/or increased ATP consumption. Aβ1-42 peptides also influenced mitochondrial membranes. Mitochondrial membrane potential (MMP) was analyzed via reduced MitoTrackers® by flow cytometry. In Aβ1-42 treated samples depolarization of the MMP was detected. It is explained by Aβ1-42 mediated loss in activity of CI and CII (demonstrated in this study). Aβ1-42 induced channel formation in mitochondrial membranes may also result in depolarization of the MMP. Steady-state anisotropy measurements of the fluorescent probe 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene were used as indicator for "fluidity" of mitochondrial membranes. Aβ1-42 caused an increase of "fluidity" of mitochondrial membranes. The result of anisotropy measurements proves the intercalation of the peptide into the membrane. For proteome analyses solubilized proteins obtained from isolated mitochondria were separated via two dimensional-blue-native/sodium dodecyl sulfate-polyacrylamid gel electrophoresis (2D-BN/SDS-PAGE). Protein subunits were identified by peptide mass fingerprint (PMF) with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). Quantification of protein subunits was executed on the basis of SYPRO® Ruby stained 2D-gels. A total of 41 proteins were identified for OLN-93 and 32 for SH-SY5Y, respectively. The huge advantage of 2D-BN/SDS-PAGE for the application in quantitative proteomics compared to the common method that uses denaturizing isoelectric focusing in the first dimension is the feasibility of separating hydrophobic membrane proteins as well as the preservation of protein-protein interactions. 14% of quantified subunits in OLN-93 samples were significantly influenced by Aβ1-42. Protein amounts of subunits α and β of F1FO ATP synthase (CV) monomer and dimer were reduced in Aβ1-42 treated OLN-93 samples. Thus, it is assumed that Aβ1-42 causes a reduction in ATP synthesis that explains the decreased cellular ATP concentration that was found in this study for Aβ1-42 treated OLN-93 samples. Furthermore, pyruvate kinase and a not identified protein showed decreased protein amounts upon Aβ1-42 treatment. In SH-SY5Y samples 30% of quantified subunits exhibited Aβ1-42 mediated alterations. Increased protein amounts of subunits α and β of CV dimer, subunit γ of CV monomer as well as of CII subunit SDHA were found in Aβ1-42 treated SH-SY5Y samples. These findings may be part of compensatory mechanisms to balance e.g. activity loss of CII (determined in this study) and CV. Additionally, four not identified proteins exhibited increased protein amounts. Decreased protein amounts were found for Hsp60 and three not identified proteins in Aβ1-42 treated SH-SY5Y samples. This study revealed significant Aβ1-42 induced alterations of cell physiology and mitochondrial function. Findings may contribute to the development of prevention options as well as therapies since they provide information about the early phase of AD pathogenesis.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie > Physikalische Biochemie
Date Deposited: 08 Nov 2016 15:34
Last Modified: 08 Nov 2016 15:34
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-57315
Referees: Dencher, Prof. Dr. Norbert A. and Meckel, Dr. Tobias
Refereed: 24 October 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5731
Export:
Actions (login required)
View Item View Item

Downloads

Downloads per month over past year