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Etablierung von zellbasierten Assays zur Identifizierung von Inhibitoren des Chemokins CXCL8

Jöst, Marina :
Etablierung von zellbasierten Assays zur Identifizierung von Inhibitoren des Chemokins CXCL8.
Technische Universität Darmstadt, Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie
[Ph.D. Thesis], (2016)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Etablierung von zellbasierten Assays zur Identifizierung von Inhibitoren des Chemokins CXCL8
Language: German
Abstract:

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Bereitstellung der zur Identifizierung von Inhibitoren des inflammatorischen und angiogenetischen Chemokins CXCL8 benötigten Assaykomponenten. Aufbauend auf diesen sollte ein häufig verwendeter Aktivitätsassay basierend auf intrazellulärer Calciumfreisetzung etabliert werden und die Übertragbarkeit des für Bindungsstudien traditionell eingesetzten Radioligand-Assays auf eine auf Messung der Fluoreszenzanisotropie basierende Durchführung geprüft werden. Durch Transfektion von HEK293-Zellen mit der cDNA des CXCR1 oder CXCR2 konnten mehrere, jeweils einen der Rezeptoren stabil exprimierende Einzelklone selektiert und kultiviert werden. Der Nachweis der Rezeptorexpression wurde durchflusszytometrisch und mittels Western-Blot-Analyse durchgeführt, wobei falsch-positive Ergebnisse letztlich mittels konfokaler Mikroskopie identifiziert wurden. In Kombination dieser drei immunologischen Nachweise wurden die Zelllinien HEK293/CXCR1-C11 und HEK293/CXCR2- IIH8 als vielversprechender Ersatz für neutrophile Granulozyten, welche eine hohe endogene Expression der beiden Rezeptoren aufweisen, bereit gestellt. Zur Bestätigung der biologischen Aktivität der Rezeptoren wurde ein Calcium-Assay mit frisch isolierten neutrophilen Granulozyten etabliert und auf die adhärenten, transfizierten HEK293-Zellen erfolgreich übertragen. Hierzu wurden sowohl Negativkontrollen bezüglich der Zelllinie und damit Rezeptoren mit den (humanen) CXCR1 und CXCR2 nicht endogen exprimierenden CHO-Zellen als auch der Ligandlösung durch Injektion des Tripeptids fMLP durchgeführt. Der Zusatz von BSA zum Puffer zur Reduzierung unspezifischer Wechselwirkungen des Proteins und der Inhibitoren zu Gefäßwänden wurde ebenfalls untersucht und ermöglichte die Inhibierung des durch CXCL8 ausgelösten Signals bei der Durchführung des optimierten Assays bei Injektion physiologischer Konzentrationen des Chemokins. In diesem Zusammenhang wurde auch bestätigt, dass BSA selbst keinen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration auslöst. Zusätzlich wurde dieser Assay sowohl mit neutrophilen Granulozyten als auch den transfizierten, CXCR1 exprimierenden Zellen, zur Bestätigung der Aktivität des im Arbeitskreis von Dorothea Helmer synthetisierten Inhibitorpeptids CXCL8-RPLoops eingesetzt. Zusätzlich konnten die CXCR1 stabil exprimierenden Zellen im Arbeitskreis zur Etablierung eines Chemotaxis-Assays im Transwell-Format genutzt werden, durch welchen die biologische Aktivität der Rezeptoren nochmals bestätigt werden konnte. Zur Durchführung von Bindungsstudien wurden verschiedene Methoden zur Anfertigung von Membranpräparationen der Zelllinien verglichen und die Rezeptoren mittels Western Blot-Analyse dieser Membranpräparationen in diesen in Form jeweils einer Monomer- und Dimerbande des jeweiligen Rezeptors nachgewiesen. Hierbei konnte auch gezeigt werden, dass die hier verwendeten HEK293-Zellen den Rezeptor des Chemokins CXCL12, CXCR4, endogen exprimieren und dieser mit CXCR1 Heterodimere bildet. Neben dieser Etablierung der die Rezeptoren exprimierenden Zelllinien und deren Membranpräparationen wurde der Ligand, CXCL8, sowie eine Mutante, CXCL8S72C, durch Modifizierung der im Arbeitskreis bereits etablierten rekombinanten Expression hergestellt und chromatographisch gereinigt. Die genannte Proteinmutante wurde mit verschiedenen maleimid-funktionalisierten Fluorophoren, Fluorescein-5-Maleimid, CFTM633-Maleimid und DyLight®550-Maleimid (DL550) konjugiert. Zusätzlich wurde ein Rutheniumkomplex als Langzeitfluorophor mit einem bifunktionalen Linker versehen und ebenfalls mit CXCL8S72C konju- 151 giert. Ein Vergleich der verschiedenen Proteinkonjugate zeigte, dass sich CXCL8S72C-CFTM633 hier nicht zur Messung der Fluoreszenzanisotropie eignet. Sowohl mit CXCL8S72C-DL550 als auch CXCL8S72CFluorescein konnten Bindungskurven bei Inkubation des Proteinkonjugats mit unterschiedlichen Konzentrationen an Membranpräparation dargestellt werden, obgleich der orange-gelbe Farbstoff eine zu geringe dynamische Breite und zudem unterschiedliche Werte der Fluoreszenzanisotropie des freien Tracers zeigte. Dies könnte mit einem zu beweglichen Fluorophor am Protein (Propellereffekt) und hieraus unterschiedlichen Konformationen des Fluorophors am Protein (starr am Protein gebunden und frei beweglich) erklärt werden.Während Fluorescein selbst keineWechselwirkung mit der Membranpräparation einging, ist die beobachtete Bindung von CXCL8S72C-DL550 zudem auf die Bindung des Farbstoffs DyLight®550-Maleimid zurückzuführen, weshalb sich dieses Proteinkonjugat aus mehreren Gründen zusammenfassend ebenfalls nicht zur zukünftigen Optimierung eines Fluoreszenzanisotropieassays eignet. Der Zusatz von BSA zur Reduktion unspezifischer Wechselwirkungen, ähnlich zur Durchführung des Calcium-Assays, ist wegen einer Wechselwirkung des Fluoresceinkonjugats mit diesem Protein nicht möglich. Zusätzlich wurde eine weitere Methode zur Quantifizierung unspezifischer Wechselwirkungen, die Zugabe eines Überschusses an nicht markiertem CXCL8 getestet. Aufgrund der bekannten Dimerisierung des Chemokins wurde die Bindung zwischen markiertem und unmarkiertem CXCL8 untersucht und im verwendeten Puffer (TRIS-T) mit beiden Tracern, CXCL8S72C-Fluorescein und CXCL8S72C-DL550, eine Bindungsaffinität von etwa 1μM ermittelt, wodurch sich die Verwendung des Chemokins als sogenannter kalter Ligand erübrigt. Zusammenfassend stehen im Arbeitskreis nun sowohl CXCR1- als auch CXCR2-stabil exprimierende Zelllinien als auch mit verschiedenen Fluorophoren konjugierte Varianten der Chemokinmutante CXCL8S72C zur Verfügung, welche für weitere Aktivitäts- und Bindungsassays eingesetzt werden können. Die zukünftige Etablierung eines Fluoreszenzanisotropieassays zum Screening kleiner Inhibitoren des Chemokins scheint letztlich möglich, jedoch muss einerseits die Bindung des CXCL8 an GAGs als auch die Dimerisierung dieses Chemokins bei der Etablierung beachtet und hierfür geeignete Lösungen gefunden werden. Bezüglich der hier hergestellten Konjugate sollten für einen solchen Assay Fluorophore mit einer höheren Quantenausbeute gewählt werden, damit die zur korrekten Berechnung der Dissoziationskonstanten nötige Tracerkonzentration kleiner der bekannten Dissoziationskonstanten eingesetzt werden kann.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Being an inflammatory and angiogenetic protein, interleukin-8 (CXCL-8) is involved in the progress of autoimmune diseases and cancer. Hence, the inhibition of the interaction between CXCL-8 and its G-protein- coupled receptors, CXCR1 and CXCR2, is an important target in drug discovery. The aim of this work was (1) the preparation of components needed for establishment of cell-based assays to identify inhibitors and (2) to combine them for establishment of a binding assay, based on fluorescence polarization and a calcium-release assay. Finally, the calcium assay should be used both, (3) to show biological activity of the recombinant expressed receptor-ligand- complex and (4) to confirm potential inhibitors. Therefore, HEK293 cells expressing either CXCR1 or 2 were established and characterized by different immunohistochemical methods, such as Western blot analysis of cell lysates, followed by fluorescence activated cell sorting. Reducing cross-reactions, confocal fluorescence microscopy was used to confirm recombinant receptor expression. In order to perform binding assays, a method for membrane preparation was established. The described expression und purification of the mutant of the chemokine, CXCL8S72C was optimized. Regioselective labeling was done by Michael addition using different fluorophores, namely CFTM633-maleimide, DL550-Maleimid and Fluorescein-maleimid. In addition, a ruthenium complex was functionalized and conjucated with CXCL8S72C. For establishment of a calcium-release assay, neutrophil granulocytes, which express both receptors endogenously, were used and the method was adapted to transfected HEK293. CHO-cells without expression of human CXCR1/2 were used as negative control, whereas no signal was observed. Calcium release was inhibited by anti-IL8 and the inhibitor peptide CXCL8-RPLoops, which shows the ability to use the assay for verifying inhibitors. In fluorescence polarization assays the polarization correlates with the rotational mobility of the fluorophore. Since small (fluorescently) labeled ligands bind to larger molecules, polarization decreases. For this reason, desired and undesired interactions of the tracer contribute to measured signals. Therefore, using BSA to avoid non-specific binding, as well as an excess of unlabeled CXCL8 ("cold ligand") requires to check for an interaction of BSA or CXCL8 with tracer molecules. In this context CXCL8 showed dimerization with a binding affinity of approx. 1µM and would cause another binding equilibrium to the focused interaction of ligand and receptor, additionally. In contrast to protein conjugates, both fluorophores (DL550- Maleimide and Fluorescein) certainly bind to BSA, thus this protein was not used to reduce non-specific binding. In preliminary experiments the incubation of a variable concentration of plasma membranes of CXCR1-expressing cells with a constant amount of tracer yielded a saturation curve, which has to be optimized in order to differentiate specific from non-specific binding. In comparison of CXCL8S72C-DL550 and CXCL8S72C-Fluorescein, the first tracer showed a small dynamic range and propeller effect. Therefore, the green tracer was used for experiments with plasmamembranes of CXCR2 expressing cells. However, a brighter fluorophore should be chosen for correct determination of binding constants by reducing the used concentration of tracer which should not be more than KD.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Divisions: 07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie
07 Fachbereich Chemie > Fachgebiet Biochemie > Biologische Chemie
Date Deposited: 15 Aug 2016 10:06
Last Modified: 15 Aug 2016 10:06
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-56331
Referees: Schmitz, Prof. Dr. Katja and Kolmar, Prof. Dr. Harald
Refereed: 12 July 2016
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5633
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