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Untersuchungen zur Initiation der Translation in halophilen Archaea

Sartorius-Neef, Simone :
Untersuchungen zur Initiation der Translation in halophilen Archaea.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2005)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Untersuchungen zur Initiation der Translation in halophilen Archaea
Language: German
Abstract:

In dieser Arbeit wurde die Initiation der Translation in halophilen Archaea untersucht, dazu wurden verschiedene Gene der gasvesikel-codierenden Region aus Hb. salinarum PHH1 verwendet. Für die Analyse der Shine-Dalgarno-Sequenz (SD-Sequenz) wurde das p-gvpH-Gen verwendet. Dieses besitzt 7 nt stromaufwärts des Startcodons eine mögliche SD-Sequenz, die mit 7 nt mit der am 3′-Ende des 16S rRNA gelegenen Anti-SD-Sequenz übereinstimmt. Als Reporter diente dabei das GvpH-Protein bzw. BgaH, ein halobakterielles Enzym mit ß-Galaktosidase-Aktivität. Die Untersuchungen zeigten, dass eine vollständig mutierte SD-Sequenz zu weniger Produkt führte, als wenn die SD-Sequenz vorhanden war. Eine 4 nt scanning-Mutagenese des 5′untranslatierten Bereichs (5′-UTR) des gvpH-Gens zeigte, dass diese 7 nt-lange Sequenz wichtig aber nicht zwingend erforderlich für die Initiation der Translation ist. Der 5′-Bereich des SD-Elements (GGAGG) stellt das Kernmotiv dar, da Mutationen in diesem Bereich die Translation stärker negativ beeinflussten als Mutationen im 3′-Bereich. Die vollständige Mutation der SD-Sequenz führte zu einer stark reduzierten BgaH-Aktivität, aber nicht zum vollständigen Verlust, was zeigt, dass das SD-Element nicht essentiell für eine erfolgreiche Translation ist. Veränderungen des 7 nt langen Abstandes zwischen der SD-Sequenz und dem Startcodon zeigten, dass der Abstand 4 oder 10 nt betragen kann, ein Abstand von nur 1 nt allerdings zu gering ist und letztlich die Translation verhindert. Als Beispiel für eine mRNA, die in ihrem mRNA leader keine SD-Sequenz besitzt, wurde das p-gvpA-Gen verwendet. p-gvpA besitzt eine 20 nt langen leader, der nicht translatiert wird. Mittels der scanning-Mutagenese konnte hier kein Bereich bestimmt werden, der die Translation besonders beeinflusst. Eine Verkürzung des leaders von 20 auf 14 nt führte zu einer um das 40fach erhöhten BgaH-Aktivität, eine vollständige Deletion zu einer 100fachen Erhöhung. Der mRNA-leader könnte deshalb an der negativen Regulation der Translation beteiligt sein. Es wurde daher auch der mRNA-leader des p-gvpD- und p-gvpF-Gens untersucht. Dabei zeigte sich, dass jeweils das leader-lose Transkript stärker translatiert wurde als das leader-enthaltende Transkript. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde ein Vektor zur Überexpression des p-gvpE-Gens konstruiert. Dazu wurde die PA-Promotorregion mit dem Transkriptionsstart direkt an den p-gvpE-Leserahmen fusioniert. Im SDS-PAGE zeigte sich eine starke Überexpression von p-gvpE, dass anschließend proteinchemisch aufgereinigt werden soll.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
The initiation of translation was investigated in halophilic archaea using different genes enconding gas vesicles of Hb. salinarum PHH1. The p-gvpH gene was used for investigation of a putative Shine and Dalgarno sequence (SD sequence). This gene contains 7 nt upstream of the start codon a putative SD sequence, which is with 7 nt complementary to an 8 nt sequence found near the 3′-end of the 16S rRNA. The GvpH protein or BgaH, a halobacterial enzyme with ß-galactosidase activity were used as reporters. The investigations indicated that a complete mutation of the SD sequence resulted in less amounts of product compared to the leader sequence containing an SD sequence. A 4 nt scanning mutagenesis of the 5′-UTR of the gvpH gene pointed out, that the sequence 7 nt uptream of the start codon functions as SD element, but is not required for an initiation of translation. The 5′-region of the SD element appeared to be the core motif, since mutations in that region had a stronger influence on translation compared to mutations in the 3′-region of the SD element. A complete mutation of the SD element resulted in a reduced BgaH activity, but not in a complete loss. Varying the distance between the SD sequence and the start codon indicated that the distance can be 4 or 10 nt, whereas a distance of only 1 nt was to short and prevented translation. The p-gvpA gene containing a 20 nt long leader region was used as an example for an mRNA lacking an SD element. The scanning mutagenesis indicated no specific region of special importance for translation. A shortening of the leader from 20 to 14 nt resulted in a 40-fold enhanced BgaH activity, whereas the complete deletion of the leader resulted in a 100-fold increase. Further analyses on the p-gvpD and p-gvpF mRNA leaders demonstrated that a deletion of the leader always resulted in enhanced BgaH activities compared to the activity derived from the respective mRNA containing the mRNA leader. A vector for the overexpression of the p-gvpE gene was constructed. Therefore the PA promotor was directly fused to the p-gvpE open reading frame. The SDS-PAGE indicated an enhanced expression of p-gvpE that now should be purified.English
Uncontrolled Keywords: Halobakterium salinarum, Initiation der Translation, SD-Sequenz, Shine-Dalgarno-Sequenz, Gasvesikel, vac-Region, mRNA-Stabilität, mRNA-rRNA Wechselwirkung, leader-lose mRNA
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Halobakterium salinarum, Initiation der Translation, SD-Sequenz, Shine-Dalgarno-Sequenz, Gasvesikel, vac-Region, mRNA-Stabilität, mRNA-rRNA Wechselwirkung, leader-lose mRNAGerman
Halobacterium salinarum, translation initiation, Shine and Dalgarno sequence, SD sequence, gene regulation, mRNA stability, leaderless mRNA, mRNA-rRNA interaction, gas vesicles, vac-regionEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:22
Last Modified: 07 Dec 2012 11:51
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000555
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-5557
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas and Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn
Advisors: Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas
Refereed: 25 January 2005
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/555
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