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Characterization of flavin-dependent tryptophan halogenases and their application in plant metabolic engineering

Fräbel, Sabine :
Characterization of flavin-dependent tryptophan halogenases and their application in plant metabolic engineering.
Technische Universität, Darmstadt
[Data], (2016)

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Title: Characterization of flavin-dependent tryptophan halogenases and their application in plant metabolic engineering
Language: English
Abstract:

A huge variety of halogenated metabolites found in nature have a profound pharmacological effect or act as antimicrobials like the antibiotics, vancomycin and chloramphenicol, or the antitumor agent, rebeccamycin. Due to the high demand for halogenated compounds, which can be met only partially by chemical synthesis, intense research effort has been undertaken to characterize enzymes catalyzing halogenation reactions in nature and to uncover their reaction mechanisms with the aim to utilize biotechnological production strategies for the retrieval of these high-value compounds. Within the last 15 years, several bacterial flavin-dependent tryptophan halogenases have been characterized in terms of their regiospecific chlorine substitution of arenes. In this regard, halogenation of pharmacologically important secondary metabolites is of special interest, to introduce novel functions into given compounds or enable further modification of the skeleton by substitution. Also, capability of tryptophan-halogenases for application in plant biotechnology has been initially tested. Biosynthesis of chlorinated monoterpene indole alkaloids (MIAs) was previously demonstrated in Catharanthus roseus through halogenation of a precursor molecule by two tryptophan halogenases. Based on these findings, catalytic activity of three tryptophan halogenases, namely, RebH wt, RebH Y455W and Stth, was investigated in detail regarding subcellular localization, biosynthesis of valuable fine chemicals and modification of the precursor of all MIAs, strictosidine. In this regard, both the 7-halogenase, RebH wt as well as the 6-halogenase, Stth efficiently catalyzed chlorine substitution of tryptophan and tryptamine in the cytosol and chloroplasts of transiently transformed Nicotiana benthamiana. Halogenated products accumulated in high concentrations, up to 6.17 ± 2 ng/mg fresh weight (6-chlorotryptamine). Strikingly, both halogenases were active in chloroplasts without the partner reductase, RebF, whereas no enzymatic activity was observed after translocation to the apoplast. Moreover, tandem halogenation of tryptophan, but not tryptamine, was observed when both enzymes were co-localized in the cytosol or chloroplasts. RebH wt alone also synthesized minor amounts of di-chlorotryptophan. Additionally, both enzymes were shown to efficiently catalyze bromide substitution of tryptophan, resulting in a variety of mono-brominated and di-brominated tryptophan molecules as well as chloro-bromotryptophan. The engineered 7-halogenase, RebH Y455W, reported to predominantly chlorinate tryptamine instead of tryptophan, showed only low catalytic activity in planta. This inefficiency could not be compensated by optimization of the metabolic flux through anchoring of the involved enzymes within a protein scaffold. On top of the aforementioned studies on MIA biosynthesis, the halogenases were also incorporated into a newly designed indoxyl biosynthetic pathway to synthesize chlorinated indican derivatives in planta. Introduction of tryptophanase TnaA from Escherichia coli, into a previously investigated artificial indican pathway resulted in high yields of 6- and 7-chloroindican. Moreover, subcellular localization of enzymes of this optimized metabolic route was shown to be very flexible and allowed both co-localization and separation of enzymes in the cytosol and chloroplasts. Remarkably, the human CYP450 2A6 mutant L240C/N297Q was also active in chloroplasts, which implies transport of electrons required for substrate oxidation, presumably from the photosystem I, to the cytochrome P450. Further optimization of this production system by introduction of additional enzymes or establishment of stable transgenic tobacco plants and cell cultures might enable efficient and ecological biosynthesis of a huge variety of highly valuable indigoids in planta. To reach the final goal of obtaining halogenated monoterpenoid indole alkaloids in a synthetic pathway, reconstitution and modification of the strictosidine biosynthetic pathway was analyzed in planta. In this regard, accumulation of 14 new metabolites was associated with transgene expression; biosynthesis of five of those was enhanced by co-infiltration of the initial precursor, geraniol, whereas four were synthesized exclusively upon geraniol supplementation. However, no actual pathway intermediates could be identified within this group. Even though biosynthesis of precursors was enhanced and constitutive gene expression was facilitated by establishing transgenic tobacco lines, no metabolites of interest were observed. Therefore, the biosynthetic track needs to be further optimized by elimination of potential bottlenecks and replacement of the inefficient RebH Y455W by wild type halogenases. Taken together, the analyzed flavin-dependent tryptophan halogenases represent promising tools for biosynthesis of valuable molecules. Their substantive efficiency enables economical production of halogenated metabolites in high yields in planta.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Eine Vielzahl natürlich vorkommender halogenierter Substanzen besitzt eine nachgewiesene antimikrobielle oder pharmakologische Wirkung wie beispielsweise die Antibiotika Vancomycin und Chloramphenicol oder das potentielle Chemotherapeutikum Rebeccamycin. Aufgrund der großen Relevanz sowie der aufwendigen und schwierigen chemischen Synthese dieser Substanzen wurde intensiv an der Identifizierung und Charakterisierung halogenierender Enzyme sowie den zugrunde liegenden Reaktionsmechanismen geforscht. Innerhalb der letzten 15 Jahre wurden dabei verschiedene bakterielle, Flavin-abhängige Tryptophan-Halogenasen charakterisiert und hinsichtlich ihrer regio-spezifischen Substitution von Chlorid an aromatische Ringsysteme untersucht. Von großem Interesse ist dabei die Halogenierung sekundärer Pflanzenstoffe, um neue Wirkmechanismen hervorzurufen oder eine weitere Modifizierung des Moleküls durch Substitutionsreaktionen zu vereinfachen. Daher ist die Anwendung dieser Enzyme in der Pflanzenbiotechnologie von großem Interesse. Die erfolgreiche Biosynthese chlorierter monoterpenoider Indolalkaloide (MIAs) durch die Halogenierung von Vorläufermolekülen durch die Tryptophan-Halogenase RebH wurde bereits in Catharanthus roseus beschrieben. Basierend auf diesen Erkenntnissen wurden die drei Tryptophan-Halogenasen RebH wt, RebH Y455W und zum ersten Mal Stth hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, der Synthese hochwertiger Feinchemikalien sowie der Modifizierung von Strictosidin, das Vorläufermolekül aller MIAs, untersucht. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass sowohl RebH wt als auch Stth die Chlorierung von Tryptophan und Tryptamin mit großer Effizienz im Cytosol sowie in Chloroplasten katalysieren. Die halogenierten Produkte akkumulierten in hohen Konzentrationen mit bis zu 6.17 ± 2 ng/mg Frischgewicht (6-Chlortryptamin) in transient transformierten Nicotiana benthamiana Blättern. Bemerkenswerter Weise waren beide Halogenasen auch ohne die Flavinreduktase RebF in Chloroplasten aktiv, während im Apoplasten keine enzymatische Aktivität nachgewiesen werden konnte. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die Co-Lokalisation beider Enzyme im Cytosol oder den Chloroplasten eine Doppelhalogenierung von Tryptophan, jedoch nicht von Tryptamin, bewirkt. RebH wt synthetisierte alleine ebenfalls geringer Mengen an Dichlortryptophan. Außerdem waren beide Halogenasen in der Lage, Tryptophan in sehr effizienter Weise zu bromieren, was zur Synthese mono- und dibrominierter Tryptophanderivate sowie Chlor-Bromtryptophan führte. Im Gegensatz dazu wies die Halogenase-mutante, RebH Y455W, welche Tryptamin anstelle von Tryptophan umsetzt, nur eine sehr geringe Aktivität auf. Diese Ineffizienz konnte auch durch die Verbesserung des Metabolitenflusses, nach Verankerung aller relevanten Enzyme an einem Proteingerüst, nicht kompensiert werden. Neben der katalytischen Charakterisierung, wurden die drei Halogenasen in den ursprünglich von Warzecha et al. entwickelten Indoxyl-Biosyntheseweg integriert, um auf diese Weise die Produktion halogenierter Indikanderivate in planta zu ermöglichen. Die Synthese dieser wertvollen Feinchemikalien war jedoch weder nach transienter oder stabiler Transformation von Tabak nachweisbar. Die Optimierung des Synthesewegs durch Integration der Tryptophanase TnaA aus Escherichia coli resultierte zuletzt in einer hohen Akkumulation von 6- und 7-Chlorindikan. Des Weiteren, ist der optimierte Syntheseweg äußerst flexibel und erlaubt sowohl eine Co-Lokalisation als auch die Aufteilung der Enzyme zwischen dem Cytosol und den Chloroplasten. Interessanter Weise konnte für die die humane Cytochrom P450 Mutante, 2A6 L240C/N297Q, in Chloroplasten ebenfalls eine hohe Aktivität nachgewiesen werden, was auf einen alternativen Elektronentransport, vermutlich vom Photosystem I, hindeutet. Eine weitere Optimierung dieses Produktionssystems durch die Einführung weiterer Enzyme sowie der Etablierung transgener Tabakpflanzen oder Zellkulturen, ermöglicht die effiziente und ökologische Produktion einer Vielzahl halogenierter Indigoide in planta. Zuletzt wurde die Rekonstitution sowie die Modifikation des Strictosidin-Biosynthesewegs zur Produktion halogenierter Derivate dieses MIA-Vorläufermoleküls untersucht. Dabei konnten 14 Metaboliten detektiert werden, deren Akkumulation mit der Expression der Transgene korrelierte; die Biosynthese fünf dieser Moleküle wurde durch die Zugabe des Vorläufers Geraniol verstärkt, während vier Substanzen ausschließlich nach Geraniol-Applikation nachweisbar waren. Allerdings konnte keiner dieser Metaboliten dem Strictosidin-Biosyntheseweg zugeordnet werden. Auch die weitere Optimierung durch eine verbesserte Synthese von Vorläufermolekülen sowie der konstitutiven Genexpression in transgenem Tabak, führte nicht zur Akkumulation der gewünschten Moleküle. Um eine effiziente Produktion halogenierter Strictosidinderivate zu ermöglichen, müssen daher Engpässe im Biosyntheseweg beseitigt und die ineffiziente Mutante RebH Y455W durch Wildtyphalogenasen ersetzt werden. Zusammengefasst ist die Verwendung der hier untersuchten Flavin-abhängigen Tryptophan-Halogenasen zur Biosynthese wertvoller Moleküle in Pflanzen sehr vielversprechend. Ihre hohe Effizienz ermöglicht eine wirtschaftliche und ökologische Produktion wertvoller halogenierter Substanzen mit großen Ausbeuten in planta.German
Place of Publication: Darmstadt
Alternative keywords:
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UNSPECIFIEDGerman
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology > Plant Biotechnology and Metabolic Engineering
Date Deposited: 22 Mar 2016 07:21
Last Modified: 22 Mar 2016 07:21
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-53576
Referees: Warzecha, Prof. Dr. Heribert and Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 18 December 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5357
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