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Etablierung einer 3R-Alternativmethode für die Chargenprüfung von bovinem Tuberkulin unter Berücksichtigung mykobakterieller Lipidantigene im Meerschweinchenmodell

Spohr, Christina :
Etablierung einer 3R-Alternativmethode für die Chargenprüfung von bovinem Tuberkulin unter Berücksichtigung mykobakterieller Lipidantigene im Meerschweinchenmodell.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Etablierung einer 3R-Alternativmethode für die Chargenprüfung von bovinem Tuberkulin unter Berücksichtigung mykobakterieller Lipidantigene im Meerschweinchenmodell
Language: German
Abstract:

Schon Robert Koch beschreibt Experimente, in denen er Meerschweinchen intradermal Tu-berkulin injiziert. Basierend auf seiner Arbeit entwickelte Clemens von Pirquet den Tuberkulin-Hauttest, der bis heute zur Diagnose von Tuberkulose Anwendung findet. Tuberkuline werden sowohl in vitro als auch in vivo verwendet. Tuberkulin ist eine Antigenpräparation, die aus den Überständen von Mykobakterienkulturen gewonnen wird. Während des schwer zu standardisierenden Herstellungsprozesses wird der Überstand mit Dampf hitzeinaktiviert und zur Proteinanreicherung filtriert oder gefällt. Phenol darf zu Konservierungszwecken aufge-nommen. Tuberkuline für die humanmedizinische Anwendung werden aus M. tuberculosis-Kulturen gewonnen; die für die Anwendung im Rind aus M. bovis-Kulturen. Weitere Tuberku-line sind nach dem jeweiligen Mykobakterienstamm, auf dem sie basieren, definiert. Deswe-gen muss jede Tuberkulincharge vor Marktzugang auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Bis heute werden Tuberkuline in vivo im Meerschweinchen getestet. Der Test wird in Überein-stimmung mit dem Europäischen Arzneibuch durchgeführt und basiert auf einer Sensibilisie-rung der Meerschweinchen mit entweder lebenden oder inaktivierten Mykobakterien. Min-destens vier Wochen später werden die Flanken rasiert und verschiedene Konzentrationen eines Referenztuberkulins und der einer Testcharge intradermal injiziert. Die Dosis wird dabei so gewählt, dass Läsionen mit einem Durchmesser zwischen 8 – 25 mm entstehen. Die Durchmesser werden vermessen und die Wirksamkeit der Testcharge mittels Regressions-analyse ermittelt. Damit erhält man eine Dosis-Wirkungskurve und die Wirksamkeit der Test-charge wird anhand der Wirksamkeit des Referenztuberkulins berechnet. Während der Hitzeinaktivierung wird ein Großteil der proteinergen Antigene im Tuberkulin denaturiert. Das erschwert eine rein molekularbiologische Wirksamkeitsprüfung und ist der Primärgrund für die Notwendigkeit des Tierexperiments. Der Tuberkulin-Hauttest hat einige Nachteile, wie den subjektiven Endpunkt bei der Datenerhebung, die Platzbegrenzung des Tierkörpers für nur wenige Testkonzentrationen, der geringen Reproduzierbarkeit und dem Stress für die Labortiere durch die Induktion von schmerzhaften, teilweise nekrotisierenden Läsionen. Daraus resultiert das Ziel in dieser Dissertation eine neue Methode für die Char-genprüfung von bovinen Tuberkulinen zu etablieren. Die neue Testmethode basiert auf direk-ter Messung tuberkulin-spezifischer T-Zell-Proliferation, da die zelluläre Immunantwort einer Hypersensitivierungsreaktion Typ IV folgt und auch diese im Hauttest abgerufen wird. Der in vitro Proliferationsassay wurde in Übereinstimmung mit dem 3R-Konzept von Russel und Burch etabliert und soll die Tiere während des Experiments entlasten. Die letale Infektion mit Mycobacterium bovis wurde mit der Nutzung hitzeinaktivierter Feuchtmasse des M.bovis-Stamms AN5 ersetzt. Es war Ziel den für die Tiere am stressigsten Teil zu ersetzen und die Methode mit objektiver Datenerhebung mittels Durchflusszytometrie zu verbessern. Für die neu etablierte Methode werden mindestens sieben Meerschweinchen mit hitzeinakti-vierter Feuchtmasse des M.bovis-Stamms AN5 sensibilisiert. An Tag 30 wird Blut entnom-men und PBMCs (engl. Peripheral blood mononuclear cells) mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Die PBMCs werden mit CFSE (Carboxyfluorescein-succimidylester) gefärbt und mit acht verschiedenen Tuberkulin-Konzentrationen stimuliert. Dabei wird die T-Zell-Antwort auf eine Testcharge mit der auf ein Referenztuberkulin vergli-chen. Nach fünf Tagen wird die Verringerung der CFSE-Färbung als Messpunkt für Zell-proliferation mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Wegen der Komplexität der zugrunde liegenden immunologischen Prozesse, ist die Variabilität der Ergebnisse in beiden Methoden – besonders die Unterschiede zwischen den Einzeltieren einer Gruppe – relativ hoch. Diese Beobachtung wird aber regelmäßig bei biologischen Wirksamkeitsprüfungen gemacht. Trotzdem war der Proliferationsassay im direkten Vergleich zum Hauttest wesentlich präziser. Wenn das verheißt, dass die neue Methode we-sentlich verlässlichere Daten produziert, ist das zusätzlich ein Argument in Richtung Tier-schutz, da damit Testwiederholungen vermieden werden könnten. Ein weiterer Fakt ist die begrenzte Testfläche auf dem Meerschweinchenkörper, der mindestens acht Tiere pro Expe-riment erforderlich macht. Mit dem Proliferationsassay können Tierzahlen reduziert werden, da der experimentelle Aufbau das parallele Testen von mindestens zwei Chargen erlaubt. Auch das ist eine alternative Anwendung in Übereinstimmung mit dem 3R-Konzept von Rus-sel und Burch. Die in dieser Dissertation präsentierten Daten erlauben die Schlussfolgerung, dass die neue Methode die bisherige Wirkamskeitsprüfung für bovine Tuberkuline ersetzen kann. Ein weiterer, von der Tuberkulinprüfung unabhängiger Aspekt der vorliegenden Arbeit war die Etablierung einer Technik, mit Hilfe derer die T-Zell-Antwort von Meerschweinchen gegen mykobakterielle Lipidantigene untersucht werden kann. Da T-Zellen Lipidantigene im Zu-sammenhang mit Gruppe I CD1 Molekülen erkennen, war es nötig zuerst CD1-positive anti-genpräsentierende Zellen (APCs - engl. antigen presenting cells) in vitro zu generieren. Dafür wurden entsprechende Meerschweinchenzytokine rekombinant exprimiert. Mit diesen Zytokinen wurden Meerschweinchen Monozyten aus dem peripheren Blut zur Ex-pression von CD1 angeregt und anschließend als APCs im Proliferationstest eingesetzt. So konnte gezeigt werden, dass T-Zellen mykobakteriell-sensibilisierter Meerschweinchen –ähnlich wie beim Menschen – eine zelluläre Immunantwort gegen die mykobakteriellen Lipi-dantigene Lipoarabinomannan (ManLAM) und Glukosemonomykolat (GMM) ausbilden.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Robert Koch already described experiments where he used Tuberculin for intradermal injec-tion in guinea pigs. Based on this work Clemens von Pirquet developed the Tuberculin Skin Test (TST) which is still used today for the diagnosis of tuberculosis. Tuberculins are used in vitro and in vivo. Tuberculin is an antigen preparation obtained from the supernatant of mycobacterial cultures. During the manufacturing process harvested supernatant is heat inactivated via steam, cleared and protein enriched by filtration or acid precipitation. Phenol is allowed to be added as a preserving agent. Tuberculins are produced either from Mycobacterium tuberculosis culture for human use or from Mycobacterium bovis culture for bovine use. Different Tuberculins are defined according to the Mycobacteria strain they are based on. The manufacturing process includes different empiric steps that are hard to standardize. So every single Tuberculin batch has to be tested before market release. So far Tuberculins have been tested in animal experiments by using guinea pigs. The current test procedures according to the European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) rely on the sensitization of guinea pigs either with live or inactivated mycobacteria. Not less than four weeks later the flanks are shaved and different dilutions of a reference preparation and the test batch of tuberculin are injected intradermally. Doses are chosen to produce lesions ranging from 8 – 25 mm. Diameters are measured and the potency of the test batch is calculated by regression analysis. As a result of statistical analysis a dose response curve is obtained and the potency of the test tuberculin in relation to the reference tuberculin is determined. According to § 2 and § 32 of the Tierimpfstoff-Verordnung the Paul-Ehrlich-Institute as Fed-eral Institute for Vaccines and Biomedicines is the responsible institution in the federal republic of Germany for the state-controlled batch potency testing of tuberculin. Due to the heat treatment, which is the crucial inactivation step during the manufacturing process, the majority of tuberculin antigens are denatured. This impedes potency deter-mination by molecular biological methods and is one of the reasons why tuberculins are still tested in an animal experiment. However, the animal test suffers from several drawbacks including the subjective read-out, the spatial limitations that only allow for few test replicates and/or dilutions, the poor reproducibility and a significant distress for the laboratory animals through the induction of painful, sometimes necrotizing lesions. Therefore we aimed to establish a new method for batch potency testing of bovine Tuberculin. The new assay is based on the direct measurement of tuberculin-specific T cell proliferation because the cellu-lar response is the underlying cause for the type IV hypersensitivity reaction measured in the skin test. The in vitro proliferation assay is developed in accordance to the 3R con-cept of Russel and Burch and shall disburden laboratory animals during batch potency testing of Tuberculins. The lethal infection with virulent Mycobacterium bovis is replaced with another sensitization strategy by using inactivated wet mass of Mycobacteria bovis strain AN5. It was the aim to replace the most distress part of the animal experiment – the Tubercu-lin Skin Test, refine the method by using flow cytometry as an objective read-out. For the new established method seven guinea pigs are sensitized with inactivated wet mass of Mycobacterium bovis strain AN5. On day 30 blood is obtained and Peripheral Blood Mon-onuclear Cells (PBMC) are purified via Ficoll gradient centrifugation. PBMCs are stained with Carboxyfluoresceinsuccimidylester (CFSE) and stimulated with Tuberculin in eight different dilutions. The response to a test batch is compared to a standard preparation. After 5 days CFSE dilution, as a measure for cell proliferation, is determined by flow cytometry. Due to the complexity of the underlying immunological processes, the variability of the test results – in particular the differences between individual animals of one group – was relatively high with both methods. This is an observation that is frequently made with biological potency assays. “However, in a direct comparison the proliferation assay was clearly more precise than the skin test. As this may indicate that the new assay yields more reliable test results, it is also important with respect to animal welfare, because it can help to avoid test repeats. Another aspect is the spatial limitations of the current test, which requires at least eight guinea pigs per test batch. With the proliferation assay a significant reduction of animal numbers can be achieved, because the format allows to test several batches in parallel. With this, the alternative approach is in accordance with the 3R concept proposed by Russel and Burch”. The data presented in this thesis allow for the conclusion that the proliferation assay holds promise to replace the current potency assay for bovine Tuberculins. Another aspect of the current thesis was to establish the techniques to study cellular immune responses of guinea pigs in general. The particular focus was on responses to defined my-cobacterial lipid antigens. Since T cells recognize mycobacterial lipid antigens in the context of group I CD1 molecules it was necessary to generate CD1 positive antigen presenting cells (APCs) in vitro to detect CD1 restricted T cells. To this end guinea pig cytokines were recombinantly expressed and used to stimulate guinea pig monocytes to express CD1. Sub-sequently, the APCs were used to stimulate lipid-specific T cells. Using this approach it could be demonstrated, that guinea pigs mount CD1 restricted T cell responses to Lipoarabi-nomannan (ManLAM) and Glucosemonomycolate (GMM) to a similar extend as observed in humans.English
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin, Gesundheit
Divisions: 10 Department of Biology
10 Department of Biology > Microbiology and Archaea
Date Deposited: 06 Nov 2015 11:12
Last Modified: 06 Nov 2015 11:12
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-51273
Referees: Simon, Prof. Jörg and Pfeifer, Prof. Felicitas and van Zandbergen, Prof. Ger
Refereed: 22 September 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5127
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  • Etablierung einer 3R-Alternativmethode für die Chargenprüfung von bovinem Tuberkulin unter Berücksichtigung mykobakterieller Lipidantigene im Meerschweinchenmodell. (deposited 06 Nov 2015 11:12) [Currently Displayed]
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