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Entry targeted lentiviral vectors for the specific modification of distinct subsets of immune cells

Uhlig, Katharina :
Entry targeted lentiviral vectors for the specific modification of distinct subsets of immune cells.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Entry targeted lentiviral vectors for the specific modification of distinct subsets of immune cells
Language: English
Abstract:

Although pathogens are ubiquitously found in the environment, catching disease is quite scarce. This can be attributed to the action of immune cells, protecting the body from invading microorganisms. A central role in the induction and orchestration of adaptive immune responses is ascribed to antigen presenting cells (APCs), like dendritic cells (DCs), and CD4+ T lymphocytes. Due to their important functions, these cell types gained center stage in immunotherapy. Thereby, their specific modification is highly desirable for several applications, including prophylactic or therapeutic vaccination approaches and the fight against human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection. In recent years, especially viral vectors proved to be powerful tools for the modification of target cells. Among them, lentiviral vectors (LVs) are of particular interest as they are not only able to transduce dividing but also non-dividing cells. They can be retargeted to basically any receptor of choice by pseudotyping with (engineered) measles virus (MV) glycoproteins (GPs) hemagglutinin (H) and fusion protein (F). Beside transfer of genetic information, retroviral and lentiviral vectors are able to deliver heterologous proteins into their target cells when the cargo proteins are genetically fused to structural proteins of the vector particle (“protein transfer vectors”, PTVs). Taking advantage of this system, the present thesis aimed to employ lentiviral vectors for the specific modification of signaling lymphocyte activation molecule (SLAM)+ APCs and CD4+ T lymphocytes.

Initially, production of PTVs was optimized to allow maximum gene and protein transfer into transduced cells. In order to achieve targeting of SLAM-positive APCs, PTVs were pseudotyped with truncated MVwt-GPs with an established tropism for SLAM. Beside SLAM, a hitherto unknown epithelial MV receptor was postulated, to whose identification as adherens junction protein Nectin-4 the present thesis contributed to characterize SLAM- target cell populations of MVwt-GPs. Indeed, upon pseudotyping of PTVs with MVwt-GPs, marker gene and GFP, Cre or ovalbumin (Ova) cargo protein delivery was completely restricted to SLAM- and Nectin-4-positive CHO cells and naturally SLAM-expressing B cell lines, whereas broad transduction was observed for VSV-G pseudotyped control vectors. Specific excision of the loxP-flanked cerulean open reading frame in receptor-positive indicator cell lines following PTV-mediated transfer of Cre recombinase exemplarily demonstrated cytoplasmic protein transfer and unimpaired functionality of the delivered cargo protein. Finally, transfer of the model antigen Ova by MVwt-GP and VSV-G pseudotyped PTVs into receptor-positive, murine DCs in vitro or after administration into human SLAM-transgenic and control mice in vivo was shown to stimulate antigen-specific T cells, and here especially CD8+ T lymphocytes.

In contrast to SLAM-targeted PTVs, which relied on MVwt-GPs, specificity of CD4-targeted LV (CD4-LV) was achieved by pseudotyping with engineered MV-GPs, displaying a CD4-specific designed ankyrin repeat domain (DARPin) as binding domain on receptor-blinded H. H-αCD4 was well expressed on the surface of HEK-293T packaging cells allowing its efficient incorporation into CD4-LV particles and giving rise to high titer vector stocks with average yields > 10e8 transducing units/ml after concentration. In vitro, CD4-LV demonstrated absolute receptor specificity on cell lines and the naturally mixed population of primary peripheral blood mononuclear cells (PBMC), with transgene expression exclusively detectable in CD4+ but not CD4- cells. Of particular note, CD4-LV was capable to stably transduce not only activated but also resting primary CD4+ lymphocytes. Beside transduction of CD4+ T lymphocytes, also gene transfer into CD4+ human macrophages could be demonstrated in vitro. In vivo, following systemic injection of CD4-LV transferring a bicistronic gfp/luciferase reporter gene, luciferase activity in NOD-scid IL2Rγ-/- mice reconstituted with human PBMC or hematopoietic stem cells was mainly detected in lymphoid organs. Flow cytometric analyses of GFP-expression in lymphoid organs and blood confirmed the strict receptor-dependency of transduction events found in vitro also to apply in vivo. Interestingly, a clear preference for transduction of CD4+ T memory cells over naïve CD4+ T lymphocytes was observed.

Concluding, this thesis clearly demonstrated suitability of (engineered) MV-GPs pseudotyped LV for specific protein and gene delivery into distinct subsets of immune cells. By the successful generation of SLAM- and CD4-targeted LVs, which allowed specific modification of SLAM+ APCs and CD4+ T lymphocytes, including even resting T lymphocytes, respectively, the broad applicability of MV-GP based cell entry targeting approaches for diverse cell surface receptors was emphasized. Both PTVs and CD4-LV are promising tools for basic research and gene and immunotherapy, opening up new avenues for a multitude of diverse applications.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Obwohl wir permanent von einer Vielzahl von Pathogenen umgeben sind, werden wir nur selten krank. Dieses Phänomen ist auf die Gegenwart des Immunsystems zurückzuführen, das den Körper vor eindringenden Mikroorganismen schützt. Eine zentrale Rolle in der Induktion und Koordination adaptiver Immunantworten wird antigen-präsentierenden Zellen (engl. antigen presenting cells, APCs), wie dendritischen Zellen (engl. dendritic cells, DCs), und CD4+ T Lymphozyten zugeschrieben. Aufgrund ihrer bedeutenden Funktion sind diese Zelltypen in den Fokus der Immuntherapie gerückt. Ihre spezifische Modifikation ist dabei für verschiedene Anwendungen erstrebenswert, unter anderem für prophylaktische und therapeutische Impfung und die Bekämpfung von Infektionen durch das humane Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1). In den vergangenen Jahren haben sich besonders virale Vektoren als nützliche Hilfsmittel für die genetische Modifikation von Zielzellen erwiesen. Unter ihnen sind vor allem lentivirale Vektoren (LVs) von großem Interesse, da sie nicht nur mitotisch aktive, sondern auch ruhende Zellen transduzieren können. Durch Pseudotypisierung mit den modifizierten Masernvirus (MV) Glykoproteinen (GPs) Hämagglutinin (H) und Fusionsprotein (F) kann ihnen Spezifität für nahezu jeden beliebigen Rezeptor verliehen werden. Zudem können retrovirale und lentivirale Vektoren neben dem Transfer von Genen auch heterologe Proteine in ihre Zielzellen übertragen, insofern diese genetisch mit Strukturproteinen der Vektorpartikel fusioniert wurden („Proteintransfervektoren“, PTVs). Basierend auf diesem System war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, lentivirale Vektoren für die zielgerichtete Modifikation von SLAM+ (Akronym für engl. signaling lymphocyte activation molecule) APCs und CD4+ T Lymphozyten zu generieren. Initial wurde die Herstellung von PTVs optimiert, um maximalen Gen- und Proteintransfer in transduzierte Zellen zu ermöglichen. Um zudem zielgerichtet SLAM+ Zellen modifizieren zu können, wurden PTVs mit zytoplamatisch verkürzten MVwt-GPs pseudotypisiert, die bekanntermaßen einen Tropismus für SLAM aufweisen. Neben SLAM war die Existenz eines bis dato unbekannten epithelialen MV-Rezeptors postuliert worden, zu dessen Identifikation als Adhärenzverbindungsprotein Nectin-4 die vorliegende Arbeit beigetragen hat, um SLAM- Zielzellpopulationen von MVwt-GPs zu charakterisieren. Tatsächlich waren Markergen- und GFP-, Cre- oder Ovalbumin- (Ova) Cargoproteintransfer komplett auf SLAM- und Nectin-4-positive CHO-Zellen und natürlich SLAM-exprimierende B Zelllinien beschränkt, während VSV-G pseudotypisierte Kontrollvektoren einen breiten Tropismus aufwiesen. Das spezifische Ausschneiden einer loxP-flankierten cerulean-Expressions¬kassette in transduzierten, rezeptorpositiven Indikatorzelllinien, das durch die in PTVs verpackte Rekombinase Cre katalysiert wurde, demonstrierte beispielhaft sowohl den zytoplasmatischen Transfer als auch die unbeeinträchtigte Funktion des übertragenen Cargoproteins. Schlussendlich konnte gezeigt werden, dass der PTV-vermittelte Transfer des Modellantigens Ova in rezeptorpositive APCs in vitro und in für humanes SLAM transgene Mäuse oder Kontrollmäuse in vivo zur Stimulation antigen-spezifischer T Lymphozyten, und hier vor allem CD8+ T Lymphozyten, führt. Im Gegensatz zu SLAM-spezifischen PTVs, deren Tropismus auf MVwt-GPs basierte, wurde die Spezifität eines gezielt CD4+ Zellen transduzierenden LVs (CD4-LV) durch Pseudotypisierung mit modifizierten MV-GPs erreicht, wobei ein CD4-spezifisches DARPin (Akronym für engl. designed ankyrin repeat protein, konzipierte Proteine mit Ankyrinwiederholungseinheiten) als Bindedomäne an rezeptorblindes H fusioniert wurde. Die gute Oberflächenexpression von H-αCD4 in HEK-293T Verpackungszellen ermöglichte den effizienten Einbau in CD4-LV-Partikel und war Grundlage für die mit durchschnittlich > 10e8 transduzierenden Einheiten/ ml hochtitrigen Vektorstocks nach Aufkonzentration. In vitro zeigte CD4-LV absolute Spezifität für CD4+ Zelllinien und CD4+ T Lymphozyten in der natürlich gemischten Zellpopulation primärer PBMC (Akronym für engl. peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des peripheren Blutes), während keine Transgenexpression in CD4- Zellen detektiert werden konnte. Dabei ist besonders hervorzuheben, dass CD4-LV nicht nur in der Lage war, aktivierte sondern auch ruhende, primäre CD4+ Lymphozyten stabil zu transduzieren. Zudem konnten auch CD4+ Makrophagen in vitro mit dem Vektor transduziert werden. Nach systemischer Applikation von gfp/luciferase übertragendem CD4-LV wurde Luziferaseaktivität vor allem in den lymphatischen Organen von mit humanen PBMC oder hämatopoetischen Stammzellen repopulierten NOD-scid IL2Rγ-/- Mäusen detektiert. Durchflusszytometrische Analysen der GFP-Expression in lymphatischen Organen und Blut bestätigten die bereits in vitro beobachtete strikte Rezeptorabhängigkeit der Transduktion auch in vivo. Interessanterweise konnte eine bevorzugte Transduktion von CD4+ T-Gedächtniszellen gegenüber naiven CD4+ T Lymphozyten beobachtet werden. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit die Eignung von mit (modifizierten) MV-GPs pseudotypisierten LVs für den selektiven Protein- und Gentransfer in verschiedene Immunzellsubtypen gezeigt werden. Durch die erfolgreiche Herstellung SLAM- beziehungsweise CD4-spezifischer LVs, die die gezielte Modifikation von SLAM+ APCs oder CD4+ T Lymphozyten, einschließlich ruhender T Lymphozyten, erlaubten, wurde die breite Anwendbarkeit des auf MV-GPs basierenden Zelleintrittstargetings für verschiedene Zelloberflächenrezeptoren unterstrichen. Sowohl PTVs als auch CD4-LV stellen vielversprechende Hilfsmittel für Grundlagenforschung und Gen- und Immuntherapie dar und eröffnen damit neue Möglichkeiten für eine Vielzahl verschiedenster Anwendungen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 26 Oct 2015 16:34
Last Modified: 26 Oct 2015 16:34
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-50107
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Laube, Prof. Dr. Bobo and Buchholz, Prof. Dr. Christian
Refereed: 25 September 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/5010
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