Das Brugada (BrS) und das Sick Sinus Syndrom (SSS) sind vererbbare Erkrankungen, welche sich durch verschiedene kardiale Arrhythmien auszeichnen. Tachykardien und Bradykardien sowie ein sinoatrialer Block, Sinuspausen oder Herzstillstand sind klinische Manifestationen dieser Krankheiten, welche sich im Elektrokardiogramm von betroffenen Personen zeigen können. Sowohl BrS als auch SSS basieren nicht nur auf klinischen, sondern auch auf symptomatischen Eigenschaften. Symptome wie die chronotrope Inkompetenz, Schwäche, Synkopen, Herzklopfen oder atriales/ventrikuläres Flimmern bis hin zum plötzlichen Herzstillstand sind das Ergebnis solcher kardialen Arrhythmien. Das Auftreten und die Ausprägungen dieser Symptome sind phänotypisch und nicht immer existent, was die Diagnose dieser Erkrankungen nur anhand der klinischen und symptomatischen Kriterien sehr schwierig macht. In den vergangenen Jahren konnten immer mehr genetische Anomalien in Genen, welche die Unter-einheiten von Kalium-, Natrium- und Calciumkanälen kodieren, sowie in Genen, die in den Transport oder die Regulation dieser Kanäle involviert sind, mit beiden Krankheiten assoziiert werden. Ein genetisches Screening sollte daher in die Untersuchung von eventuell gefährdeten Personen mit einbezogen werden.

HCN4 ist eines der Gene, welches mit BrS und SSS assoziiert werden konnte. Es kodiert einen hyper-polarisations-aktivierten und zyklisch nukleotid-gesteuerten Kationenkanal, welcher für die reibungs-lose Funktion des Sinusknoten im Herzen wichtig ist. HCN4 ist einer von vier Isoformen (HCN1-4) und wird hauptsächlich im Gehirn und im Herzen exprimiert, um dort die autonome Aktivität eines Schrittmacherimpulses zu generieren. Diese Kanäle sind spannungs¬ab¬hängig und werden durch die Membranhyperpolarisierung aktiviert. Natrium- und Kaliumionen strömen in einem Verhältnis 1:3 oder 1:5 durch eine Pore ein, welche durch vier Untereinheiten des Kanals geformt wird. Dadurch depolarisiert die Spannung zur der Schwelle, bei der das nächste Aktionspotentail ausgelöst wird. Mutationen im HCN4 Gen können zu kardialen Dysfunktionen führen, welche häufig mit Krankheiten wie dem BrS oder SSS assoziiert sind. Bis heute wurden mehr als 23 Mutationen im HCN4 Gen identifiziert und mit klinisch etablierten oder potentiellen Dysfunktionen des Sinusknotens in Verbindung gebracht.

In der vorliegenden Arbeit wurde ein genetisches Screening von Patienten mit der Diagnose oder dem Verdacht auf Brugada oder Sick Sinus Syndrom durchgeführt, um neue Mutationen im HCN4 Gen zu identifizieren. In der kodierenden HCN4 Region von 62 Patienten wurden sechs bereits bekannte und eine neue Sequenzabweichung detektiert: zwei befinden sich in Exon 1 (N-Terminus), zwei in Exon 4 (eine in der Pore und eine am Anfang der Schleife des C-Teminus) und drei in Exon 8 (C-Terminus). Jeder der sechs bekannten Basenaustausche ist in der NCBI Datenbank (National Center of Biotechnologie) als eine Sequenzvariante ohne funktionelle Folge gelistet. Die neue Sequenz¬variante V492F war nicht in der Datenbank aufgeführt und befindet sich in der hoch konservierten Porenregion des HCN4 Kanals. Um zu prüfen, ob es sich um einen häufigen Polymorphismus oder eine neue Mutation handelt, wurden 100 Blutproben gesunder Personen untersucht. Keine dieser Proben enthielt diese neue Sequenzvariante, was auf eine Mutation schließen lässt.

Die im Anschluss durchgeführten elektrophysiologischen Untersuchungen an HEK293 Zellen, welche die HCN4-V492F Mutante und drei weitere Varianten (V492A/-D/-R) an der Proteinposition V492 exprimierten, zeigten eine reduzierte Kanalleitfähigkeit im Vergleich zu den HEK293 Zellen, welche den HCN4-WT exprimierten. Dies lässt sich nicht ausschließlich auf eine funktionelle Störung des Kanals zurückführen, sondern könnte auch Folge einer Beeinträchtigung der Proteinsynthese oder des Transportes der Proteine zur Zellmembran sein. Hierzu wurden GFP markierte HCN4-WT und mutierte Kanäle in HEK293 Zellen mittels konfokaler Laser-Mikroskopie (CLSM) untersucht. Die CLSM-Aufnahmen zeigten alle die gleiche zelluläre Verteilung und lokale Konzentration der mutierten als auch nicht mutierten HCN4 Proteine. Mittels der modifizierten Technik Napobac, wurden zusätzlich Plasmamembran-Fragmente der Zellen isoliert, welche mit der DNA des HCN4-WT oder der verschiedenen mutierten Kanäle transfiziert wurden. Diese hoch reinen Membranflecken wiesen keine nennenswerte Unterschiede in ihrer GFP Fluoreszenz¬intensität auf, was darauf hindeutet, dass ein Aminosäureaustausch in der Position 492 des HCN4 Proteins offenbar weder die Proteinsynthese noch den Transport des Kanalproteins zur Zellmembran beeinträchtigt.

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die reduzierte Leitfähigkeit der HCN4-V492F Mutante offenbar nur durch eine funktionelle Störung des Kanals verursacht wird. Die reduzierte Leitfähigkeit des HCN4 Kanals erklärt die Symptome des Mutationsträgers, welcher an unklaren Synkopen in stressfreien Situationen leidet und bestätigt den Verdacht auf Brugada Syndrom.