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Herstellung und Charakterisierung von Umweltgenbanken aus Böden zur Aufklärung von genetischen und physiologischen Eigenschaften nicht-kultivierter Crenarchaeota

Treusch, Alexander :
Herstellung und Charakterisierung von Umweltgenbanken aus Böden zur Aufklärung von genetischen und physiologischen Eigenschaften nicht-kultivierter Crenarchaeota.
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Zusammenfassung, Einleitung, Material+Methoden, Ergebnisse Teil 1 - PDF
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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Herstellung und Charakterisierung von Umweltgenbanken aus Böden zur Aufklärung von genetischen und physiologischen Eigenschaften nicht-kultivierter Crenarchaeota
Language: German
Abstract:

Mit Hilfe von 16S rDNA Analysen wurde eine neue Gruppe von Archaea, die sogenannten mesophilen Crenarchaeota, in verschiedenen marinen und terrestrischen Ökosystemen nachgewiesen. Da kein Vertreter dieser Gruppe bisher im Labor kultiviert werden konnte, sind diese Organismen noch sehr wenig charakterisiert. In dieser Arbeit wurden Genbanken mit großen klonierten DNA-Fragmenten aus verschiedenen Bodenproben angelegt, um eine Voraussetzung für das Studium der mesophilen Crenarchaeota und anderer nicht-kultivierter Mikroorganismen aus Böden zu schaffen. Dafür wurde hochmolekulare DNA aus einem nährstoffarmen Sandökosystem (RUD) isoliert und von Huminsäuren gereinigt. Zusammen mit zwei weiteren Boden-DNAs, aus einem Graslandboden und einem Mischwaldboden, wurde diese in Fosmid-Genbanken abgelegt, die insgesamt 2,5 Gbp klonierter Umwelt-DNA enthielten. Die Charakterisierung von zwei der Genbanken und einer weiteren von RUD vorhandenen wurde durch die Erstellung von randständigen Sequenzen (je Seite >700 bp) von 2.688 zufällig ausgewählten Fosmiden möglich. Die Auswertung der 5.376 Sequenzen im Umfang von insgesamt mehr als 4 Mbp zeigten, dass 1.) 56% aller Sequenzen keine Ähnlichkeiten mit Genen aus den Datenbanken aufwiesen; dass 2.) 42% der Sequenzen Ähnlichkeiten mit bakteriellen, und nur je ca. 1% mit archaealen und eukaryontischen Genen hatten; dass 3.) Protein-kodierende Gene ähnlich auf funktionelle Kategorien (COG-Kategorien) verteilt waren wie in kompletten Genomen kultivierter Mikroorganismen; dass 4.) eine große Diversität an mikrobiellen Genomen vertreten war; und dass 5.) basierend auf G+C-Gehalt und Auswertung der Treffer mit größten Ähnlichkeiten, deutliche Unterschiede zwischen den Banken in Bezug auf Herkunft und Art der Präparation der DNA zu beobachten waren. Auswertungen phylogenetischer Markergene in den Endsequenzen ermöglichten die Zuordnung von Genomfragmenten zu spezifischen phylogenetischen Gruppen. Neben einem, über ein kodiertes 16S rRNA-Gen identifiziertes Fosmid, konnten so anhand der Endsequenzen mindestens sieben weitere Fosmide nicht-kultivierten Crenarchaeota zugeordnet werden. Von drei crenarchaealen Fosmiden wurden die Sequenzen bestimmt und detailliert ausgewertet: Klon 6a13 wurde anhand eines potentiellen archaealen cdc48-Gens identifiziert, Klon 68f19 durch ein randständiges Chaperonin-Gen und Klon 54d9 durch ein rRNA-Operon. In der insgesamt 114 kb umfassenden Sequenzinformation wurden 114 offene Leserahmen gefunden. Neben Genen die für an zentralen zellulären Prozessen beteiligte Proteine kodierten, wurden auch Gene gefunden, die Hinweise auf spezielle Stoffwechselwege gaben. Besonders eine neuartige, vermutliche dissimilatorische Kupfer-enthaltende Nitritreduktase (NirK), die einzigartig durch ein C-terminal fusioniertes Amicyanin war, deutete darauf hin, dass Crenarchaeota in Böden denitrifizieren könnten. Die biochemische Bestätigung der Aktivität dieses Enzyms wurde durch Herstellung von Gen-Konstrukten mit und ohne Leserahmen für die Amicyanin-Domäne vorbereitet. Diese Konstrukte wurden heterolog im Cytoplasma und Periplasma von Escherichia coli exprimiert und die erhaltenen Proteine für Aktivierungs- und Rückfaltungsversuche verwendet. Zwei weitere gefundene Gene kodierten potentielle Proteine, die schwache Ähnlichkeiten mit Ammonium- bzw. Methan-Monooxygenasen (AmoA/PmoA) aufwiesen. In bioinformatischen Analysen konnte sowohl eine weite Verbreitung des vermutlichen amoA Gens bei mesophilen Crenarchaeota aufgezeigt werden, als auch eine strukturelle Ähnlichkeit des Proteins mit AmoA Proteinen bekannter Nitrifizierer. Anhand der gewonnenen Erkenntnisse wurde abschließend eine Hypothese über die Physiologie der nicht-kultivierten Crenarchaeota aufgestellt.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
A novel group of archaea, the mesophilic crenarchaeota, has been detected in several marine and terrestrial habitats using 16S rDNA analyses. As these organisms have not been cultivated so far, they remain poorly characterized. In this study genomic libraries were constructed from high molecular weight DNA isolated from several soil samples in order to provide a basis for the characterization of the mesophilic crenarchaeota and of other uncultivated microorganisms from soils. High molecular weight DNA was isolated from a nutrient-poor sandy ecosystem (RUD) and was purified from contaminating humic substances. Together with two other soil-derived DNAs, from a grassland soil and a mixed forest soil, the DNA was cloned into fosmid vectors resulting in genomic libraries with a total of 2.5 Gbp of environmental DNA. Two libraries constructed in this study and one further library from RUD were characterized by creating fosmid end sequences of both sides from 2,688 randomly chosen fosmids (>700 bp each). The analysis of the 5,376 reads with over 4 Mbp of sequence information revealed that 1.) 56% of the sequences showed no similarities to known genes from the databases; that 2.) 42% of the sequences showed similarities to genes from bacteria and 1% to those of archaea and eukaryotes, respectively. 3.) Furthermore, protein encoding genes were distributed among functional categories similar to those from complete genomes of cultivated microorganisms, 4.) a huge diversity of microbial genomes was present; and 5.) differences between the libraries with respect to the type of sample and the DNA preparation method could be detected. Using phylogenetic marker genes identified within the end sequences, it was possible to assign phylogenetic relationships of genome fragments. At least seven fosmids have been assigned to crenarchaeota, alongside with one crenarchaeotal fragment that was identified based on its encoded 16S rRNA gene. The sequences of three crenarchaeal fosmids were completely determined and analysed in detail: clone 6a13, which was identified by a putative archaeal cdc48 gene on one of the fosmid ends, clone 68f19, identified by a putative chaperone gene on one end, and clone 54d9, identified based on its rRNA operon. 114 open reading frames have been identified in the obtained sequence information of altogether 114 kb. Beside genes coding for proteins involved in house-keeping functions, some genes gave hints to special metabolic traits of the archaea. Especially a novel, putative dissimilatory copper-containing nitrite reductase (NirK) with a unique C-terminal fusion of an amicyanin domain pointed to a possible role of the mesophilic crenarchaeota from soil in denitrification processes. In order to be able to characterized this enzyme biochemically, several recombinant plasmids with and without the coding region for the amicyanin domain were constructed for expression in Escherichia coli. The genes were heterologously expressed in the cytoplasm and periplasm of E. coli. The resulting protein was purified and used for activity assays and for refolding experiments. Two additionally identified genes encoded putative proteins that showed weak similarities to ammonia or methane monooxygenases (AmoAB/PmoAB). Bioinformatic analyses revealed a wide distribution of the putative amoA gene within mesophilic crenarchaeota, as well as structural similarities of the deduced protein to AmoA proteins of known nitrifiers. The genomic informations gathered in this work led to a first hypothesis on the physiology of the uncultivated crenarchaeota.English
Uncontrolled Keywords: Umweltgenomik, Metagenomik, nicht-kultivierte Mikroorganismen, DNS-Reinigung, Nitrifizierung, Denitrifizierung,
Alternative keywords:
Alternative keywordsLanguage
Umweltgenomik, Metagenomik, nicht-kultivierte Mikroorganismen, DNS-Reinigung, Nitrifizierung, Denitrifizierung,German
environmental genomics, archaea, crenarchaeota, copper-containing nitrite reductase, soil libraries, diversity, denitrification, nitrification, uncultivated microorganisms, metagenomicsEnglish
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000493
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4930
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Schleper, PD Dr. Christa and Nixdorff, Prof. Dr. Kathryn
Advisors: Schleper, PD Dr. Christa
Refereed: 15 July 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/493
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