Martusewitsch, Erika (2004)
Differentielle Genexpression in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus nach Hitzeschock.
Technische Universität Darmstadt
Ph.D. Thesis, Primary publication
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Item Type: | Ph.D. Thesis | ||||
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Type of entry: | Primary publication | ||||
Title: | Differentielle Genexpression in dem hyperthermophilen Archaeon Sulfolobus solfataricus nach Hitzeschock | ||||
Language: | German | ||||
Referees: | Schleper, PD Dr. Christa ; Pfeifer, Prof. Dr. Felicitas | ||||
Advisors: | Schleper, PD Dr. Christa | ||||
Date: | 15 September 2004 | ||||
Place of Publication: | Darmstadt | ||||
Date of oral examination: | 16 July 2004 | ||||
Abstract: | In den Grundzügen ihrer zentralen zellulären Prozesse ähneln Archaea häufig den Eukaryoten und sie weisen viele homologe Proteine mit diesen auf. Diese Beobachtungen bleiben allerdings häufig auf vergleichende Genomanalysen und -vorhersagen beschränkt, da sich viele Archaea aufgrund ihrer extremen Wachstumsanforderungen nur schwer analysieren lassen. Bis heute ist daher vergleichsweise wenig über globale Genregulation z.B. nach Stressreaktionen in Archaea bekannt und darüber, welche Proteine mit dem "eukaryotischen" basalen Transkriptionsapparat interagieren. Besonders bei hyperthermophilen Archaea ist es von Interesse aufzuklären, wie die Zellen auf plötzliche Temperaturveränderungen, z.B. Hitzeschock, reagieren. Um die Hitzeschockreaktion an dem hyperthermophilen Modellorganismus Sulfolobus solfataricus studieren zu können, wurden zunächst die Bedingungen, welche Thermoadaption bzw. Hitzeschock auslösen, bestimmt. Es zeigte sich, dass der Organismus eine Thermotoleranz gegenüber letalen Temperaturen von 96°C entwickelte, wenn er vorher bei moderaten Hitzeschocktemperaturen von 88°C adaptiert wurde. In Northern-Analysen wurde 30 Minuten nach Hitzeschock bei 88°C eine verstärkte Transkription des Gens für die alpha Untereinheit des Thermosoms (TF55) festgestellt, dem Chaperonin und Hsp60-Homolog der Archaea. Für die Identifizierung von differentiell exprimierten Genen nach Hitzeschock wurde die differential display Methode (DD-PCR) für S. solfataricus etabliert und angewendet. Hierfür wurde die aus Zellen vor und nach Hitzeschock isolierte RNA in cDNA revers transkribiert und anschliessend mit Zufallsprimern amplifiziert. Dadurch wurde ein Gemisch von Amplifikaten erhalten, die ein komplexes und reproduzierbares Transkriptionsmuster vor und nach Hitzeschock lieferten. Unter Verwendung verschiedener Kombinationen von Oligonukleotiden in der DD-PCR wurden insgesamt 32 cDNA-Fragmente erhalten, deren Mengen nach Hitzeschock zunahmen. Durch Sequenzanalyse konnten diese 18 verschiedenen, potentiellen Hitzeschockgenen im S. solfataricus Genom zugeordnet werden. Darunter befand sich auch tf55alpha. In einer quantitativen PCR mit genspezifischen Primern wurden relative Zunahmen der mRNA-Mengen nach Hitzeschock bestimmt. Bei 13 der in der DD-PCR identifizierten Gene konnte eine Induktion verifiziert werden. Darunter war tf55alpha mit 10,4-fach am stärksten induziert, die übrigen, neu identifizierten Hitzeschockgene wiesen moderate Induktionen von 1,5- bis 3,1-fach auf. Zusätzlich wurden auch Homologe bekannter Hitzeschockgene und basaler Transkriptionsfaktoren in die quantitativen Analysen einbezogen. Dazu gehörten die Gene der beta und gamma Untereinheit des Thermosoms, der Chaperone Prefoldin, Hsp20-1 und 2, der Proteasen HtrA und Htpx, sowie der Transkriptionsfaktoren TBP, TFB-1 und 2. Die meisten dieser Gene waren nach Hitzeschock zwischen 1,8-fach (Prefoldin) und 5,4-fach (htrA) induziert, die Transkriptmengen von tf55gamma, tbp und tfb-2 nahmen jedoch nach Hitzeschock ab. Insgesamt wurde somit bezüglich der relativen Transkriptmengen eine moderate Hitzeschockantwort in S. solfataricus festgestellt. Sieben der neu identifizierten Hitzeschockgene konnte aufgrund von Ähnlichkeiten mit Genen aus den öffentlichen Datenbanken eine Funktion zugeordnet werden. Neben tf55alpha wurden so Gene für eine potentielle Transposase und von an diversen physiologischen Reaktionen beteiligten Proteinen identifiziert. Die übrigen Hitzeschockgene hatten bisher unbekannte Funktionen und ihr Vorkommen war allein auf die Archaea oder die Gattung Sulfolobus beschränkt. Darunter waren drei Gene, deren Proteinsequenzen in S. solfataricus zu einer sieben Mitglieder umfassenden Familie mit coiled-coil Strukuren gehörten, welche im konservierten C-Terminus ein Motiv von RecBC-Endonukleasen enthielten. Ein anderes potentielles Hitzeschockgen zeigte entfernte Ähnlichkeiten mit HrcA, einem transkriptionellen Repressor von Hitzeschockgenen in Bakterien. Um einen Einblick in die Regulation der Hitzeschockgene zu bekommen, wurden die Transkriptionsstartstellen von fünf neu identifizierten Hitzeschockproteinen sowie von tf55alpha und tf55beta bestimmt. In einer Entfernung von 21 bis 26 Nukleotide stromauf vom Transkriptionsstart wurden die basalen Promotorelemente TATA-Box und BRE-Element identifiziert, welche dem bekannten, archaealen Konsensus entsprachen. Ausserdem wurden zwei AT-reiche Strukturen zwischen den Promotoren und Transkriptionsstarts der Hitzeschockgene gefunden, die potentielle cis-regulatorische Elemente darstellen könnten. Mit dieser Arbeit konnten erste Einblicke in die Hitzeschockantwort eines hyperthermophilen Archaeons erhalten werden. Durch die Identifizierung potentieller cis-regulatorischer Elemente, eines mit dem HrcA-Repressor verwandten Proteingens sowie einer neuen, RecBC-ähnlichen Endonukleasenfamilie sind Grundlagen für die Erforschung der Hitzeschockantwort in S. solfataricus gelegt worden. |
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Alternative Abstract: |
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URN: | urn:nbn:de:tuda-tuprints-4847 | ||||
Classification DDC: | 500 Science and mathematics > 570 Life sciences, biology | ||||
Divisions: | 10 Department of Biology | ||||
Date Deposited: | 17 Oct 2008 09:21 | ||||
Last Modified: | 07 Dec 2012 11:50 | ||||
URI: | https://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/484 | ||||
PPN: | |||||
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