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Studien zur Funktion von Kaliumkanälen aus Viren eukaryotischer Algen (Phycodnaviridae)

Mehmel, Mario :
Studien zur Funktion von Kaliumkanälen aus Viren eukaryotischer Algen (Phycodnaviridae).
[Online-Edition]
TU Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2004)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Studien zur Funktion von Kaliumkanälen aus Viren eukaryotischer Algen (Phycodnaviridae)
Language: German
Abstract:

Im Genom von zwei entfernt verwandten Algenviren der Familie Phycodnaviridae wurden Kaliumkanal-ähnliche Gene gefunden. Das Paramecium bursaria Chlorellavirus kodiert Kcv, den ersten bekannten viralen Kaliumkanal. Im Genom von Ectocarpus siliculosus Virus kodiert das Offene Leseraster 223 einen weiteren möglichen viralen Kaliumkanal, Kev. Durch die heterologe Expression eines chimären Proteins aus Kcv und der Pore von Kev konnte in dieser Arbeit die Funktionalität der Kev-Kanalpore gezeigt werden. Dennoch konnte durch die heterologe Expression des Kev-wildtyp-Proteins in Säugerzellen (HEK293 und CHO) oder in Oozyten von Xenopus laevis keine spezifische Kaliumkanalaktivität an der Plasmamembran dieser Zellen nachgewiesen werden. Als Ursache für die fehlende selektive Kanalaktivität kommt die intrazelluläre Verteilung des Proteins im Expressionssystem in Frage: Confokal-mikroskopische Aufnahmen von HEK293-Zellen, die Kev-GFP Fusionsprotein exprimierten, zeigen punktförmige Fluoreszenzmaxima. Im Gegensatz dazu akkumulierte die Fluoreszenz von Kcv-GFP Fusionsprotein in tubulären, membranartigen Strukturen. Durch eine Verlängerung der carboxy-terminalen Transmembranhelix von Kev-GFP-Fusionsprotein um drei oder sechs Aminosäurereste konnte jedoch dasselbe Verteilungsmuster wie mit Kcv-GFP-Fusionsprotein hergestellt werden. Die Verteilung der untersuchten viralen Kanäle wird also von der Länge der carboxy-terminalen Transmembranhelix bestimmt. Diese Ergebnisse weisen auf eine mögliche physiologische Rolle des Kev-Proteins in der dünnen Membran des Endoplasmatischen Retikulums (ER) der Wirtszelle oder in der inneren Virusmembran von Ectocarpusviren hin, welche vom ER des Wirts abgeleitet ist. In der vorliegenden Arbeit fanden sich auch Hinweise dafür, dass der Kaliumkanal Kcv aus Chlorellaviren im Viruspartikel lokalisiert ist: (i) Kcv-mRNA wird in der späten Phase der Virusreplikation synthetisiert; während dieser Phase findet auch die Assemblierung von neuen Viruspartikeln statt. (ii) Weiter konnte eine Depolarisation des Membranpotentials bei der Infektion von Chlorella NC64A durch Chlorellaviren mit dem spannungsabhängigen Fluoreszenzfarbstoff Bis-Oxonol gemessen werden. Diese Depolarisation zeigte eine sehr ähnliche Pharmakologie wie die Kanalaktivität von Kcv in heterologen Expressionssystemen und die Replikation der Viren (in plaque-Tests). Dies deutet auf eine essentielle Funktion von Kcv während der ersten Minuten der Infektion durch Chlorellaviren hin.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Two distantly related algal viruses of the family Phycodnaviridae encode K+ channel-like genes. Paramecium bursaria Chlorella virus encodes Kcv, the first known viral K+ channel protein. Kev, a second putative viral K+ channel was derived from the genome of Ectocarpus siliculosus virus (EsV-1). The sequence of EsV-1 open reading frame 223 encodes 124 amino acids with high homology to the Chlorella virus channel Kcv. Expression of the pore region of Kev in a chimeric protein demonstrated that the Kev pore is indeed functional. Even though, Kev wildtype protein failed to induce a K+ selective conductance in heterologous expression systems HEK293 cells, CHO cells, and Xenopus laevis oocytes. The failure to detect K+ channel activity at the plasma membrane of Kev expressing cells is most probably due to the intra-cellular distribution of Kev in these cells: confocal microscopy of HEK293 cells expressing Kev-GFP fusion protein shows fluorescence signals with punctuated maxima. In contrast, Kcv-GFP fluorescence accumulates in tubular membranous structures. Kev mutants with their carboxy-terminal helix extended by 3 or 6 amino acids show a Kcv-like pattern of distribution demonstrating that the length of the carboxy-terminal helix is crucial for the cellular distribution of the channel protein. These findings indicate, that Kev function in nature might occur either at the thin membrane of the host cell endoplasmic reticulum (ER) or at the ER-derived internal membrane of Ectocarpus virus particles. The data presented in this thesis suggest that Chlorella virus channel Kcv is localised in the virion: (i) Kcv mRNA is synthesised during the late phase of viral replication when assembly of new virus particles takes place. (ii) The membrane potential of the host cells depolarises during infection of Chlorella NC64A cells by Chlorella viruses, as monitored using the potential-sensitive probe Bis-Oxonol. This host cell depolarisation exhibits a pharmacology parallel to both, viral replication, and Kcv activity in heterologous expression systems. Thus, Kcv activity seems to be essential during the first minutes of Chlorella virus infection.English
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: Biology
Date Deposited: 17 Oct 2008 09:21
Last Modified: 07 Dec 2012 11:50
Official URL: http://elib.tu-darmstadt.de/diss/000483
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-4831
License: Simple publication rights for ULB
Referees: Thiel, Prof. Dr. Gerhard and Holstein, Prof. Dr. Thomas W
Advisors: Thiel, Prof. Dr. Gerhard
Refereed: 25 June 2004
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/483
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