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Receptor-targeted viral vectors: Tracking of stem cells and side by side comparison of AAV and lentiviral vectors

Kays, Sarah-Katharina :
Receptor-targeted viral vectors: Tracking of stem cells and side by side comparison of AAV and lentiviral vectors.
Technische Universität, Darmstadt
[Ph.D. Thesis], (2015)

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Item Type: Ph.D. Thesis
Title: Receptor-targeted viral vectors: Tracking of stem cells and side by side comparison of AAV and lentiviral vectors
Language: English
Abstract:

In recent years, substantial progress in gene therapy has been made as proofed by several successful clinical trials providing substantial benefit to patients and the first marketing authorization of an adeno-associated virus (AAV) vector-based medical product. Especially lentiviral and AAV vectors represent promising tools for gene transfer. They have been further improved to ensure safety and efficiency. One strategy to customize these viral vectors is the generation of receptor-targeted vectors that restrict gene delivery to cells expressing the targeted receptor. The first part of this thesis compares lentiviral and AAV vectors targeted to the receptor Her2/neu which is overexpressed in various tumor cells. This is for the first time a true side by side comparison of this totally different vector types, since here, both use the same receptor for cell entry. The second part investigates the potential of receptor-targeted lentiviral gene transfer into human hematopoietic stem cells (HSCs) via the cell surface protein CD105 and evaluates if CD105 is a marker for human long-term repopulating HSCs. The Her2-targeted lentiviral and AAV vector had been generated and characterized before (Münch et al., 2011; Münch et al., 2013). Both particles display a Her2/neu specific targeting ligand, the designed ankyrin repeat protein 9.29. First, functional, genomic and physical titers of Her2-LV and Her2-AAV vector stocks were determined side by side to allow precise normalization of both vector types. While the Her2-LV vector stocks showed higher genomic titers, Her2-AAV vectors comprised more functional particles per genome containing particles. Accordingly, about 10-fold more genome copies of Her2-LV than Her2-AAV had to be administered systemically in a subcutaneous tumor mouse model for detectable transgene expression. Analysis of the vector distribution short time after systemic administration in vivo revealed that the non-enveloped Her2-AAV vector circulated stably in the blood of mice for a prolonged time compared to Her2-LV. Accumulation of Her2-AAV within the target tissue occurred only after 24 hours. Lentiviral vectors are currently the preferred vector type for the modification of HSCs due to their capability of integrating the transgene into the host cell’s genome. Thereby the entire hematopoietic system can be reconstituted with cells carrying the corrected gene. True HSCs which are capable of self-renewal and differentiate into all hematopoietic lineages can be identified by the expression of specific cell surface markers. In mice, CD105 was previously shown to be present on most immature, long-term repopulating HSCs. After confirming that human CD105 is expressed on 30-80% of human CD34+ cells, CD34+ cells were transduced with a lentiviral vector targeted to human CD105 (CD105-LV) and transplanted into NOD-scid IL2Rγ-/- mice. Stable reporter gene expression in engrafted cells was detected long-term in all human hematopoietic lineages in bone marrow, spleen and blood. In addition, competitive repopulation experiments in mice showed a superior engraftment of CD105-LV transduced CD34+ cells in bone marrow and spleen compared to cells transduced with a conventional non-targeted lentiviral vector confirming CD105 as a marker for early HSCs with high repopulating capacity. The data shown in this thesis highlight the potential of receptor-targeted vectors to trace cell subsets and identify new markers for specific cell populations. In addition, it demonstrates the potential of comparing vectors derived from different virus families once they have been targeted to the same entry receptor.

Alternative Abstract:
Alternative AbstractLanguage
Während der letzten Jahre wurden bedeutende Fortschritte im Bereich der Gentherapie erzielt, was durch mehrere erfolgreich durchgeführte klinische Studien, die zu therapeutischen Verbesserung für die Patienten führten, sowie durch die erste Markteinführung eines Adeno-assoziierter Virus (AAV) Vektor basierten Therapeutikums bestätigt wurde. Vor allem lentivirale und AAV Vektoren stellen vielversprechende Hilfsmittel für den Gentransfer dar. Sie wurden stetig weiterentwickelt, um deren Sicherheit und Effizienz zu gewährleisten. Eine Strategie, die viralen Vektoren anzupassen, ist das sogenannte Rezeptortargeting, das den Gentransfer nur in Zellen, die einen definierten Rezeptor exprimieren, ermöglicht. Der erste Teil dieser Dissertation vergleicht lentivirale und AAV Targetingvektoren, die an den Zielrezeptor Her2/neu, ein Oberflächenprotein, das in vielen Tumorzelltypen überexprimiert ist, binden. Dieser direkte Vergleich zeigt Einblicke in Leistung, Verteilung und Anwendbarkeit von zielgerichteten lentiviralen und AAV Vektoren. Der zweite Teil dieser Arbeit untersucht das Potential eines zielgerichteten lentiviralen Vektors Gene in hämatopoetische Stammzellen (HSZ) einzuschleusen. Der Gentransfer erfolgt nach Bindung an das Oberflächenprotein CD105 und untersucht dabei gleichzeitig, ob CD105 ein Oberflächenmarker für humane lang-zeit repopulierende HSZ ist. Lentivirale und AAV Vektoren, die über die Bindung an den Rezeptor Her2/neu Gentransfer vermitteln, waren vor Beginn dieser Arbeit generiert und charakterisiert worden (Münch et al., 2011; Münch et al., 2013). Durch die Präsentation des gleichen Targetingliganden auf der Vektoroberfläche binden beide Vektortypen an den gleichen Zielrezeptor, was einen direkten Vergleich beider Vektortypen in vitro und in vivo ermöglicht. Zunächst wurden funktionale, genomische und physische Titer von Her2-LV und Her2-AAV Vektorstocks nebeneinander bestimmt, sodass eine genaue Normalisierung beider Vektortypen ermöglicht wurde. Die Her2-LV Vektorstocks beinhalteten mehr Genomkopien, allerdings enthielten Her2-AAV Vektorstocks mehr funktionale Partikel pro Genomkopien. Daher waren etwa 10-fach mehr Genomkopien des Her2-LV als des Her2-AAV in einem subkutanen Tumormausmodell nötig, um eine effiziente Genexpression zu erreichen. Die Analyse der Vektorverteilung kurze Zeit nach intravenöser Vektorinjektion zeigte, dass der nicht behüllte Her2-AAV länger im Blut zirkuliert als Her2-LV. Während der ersten 24 Stunden nach Vektorgabe konnte keine Akkumulation von Her2-AAV Partikeln im Zielgewebe beobachtet werden. Wegen ihrer Fähigkeit, das Transgen in das Genom der Zielzelle zu integrieren, sind lentivirale Vektoren der präferierte Vektortyp für die Modifikation von HSZ. So kann das gesamte hämatopoetische System mit Zellen rekonstituiert werden, die das korrigierte Gen tragen. Echte HSZ besitzen die Fähigkeit sich selbst zu erneuern und sind gleichzeitig in der Lage, in alle hämatopoetischen Zellen auszudifferenzieren. Diese Stammzellen können anhand von bestimmten Oberflächenproteinen identifiziert werden. In Mäusen konnte CD105 als ein Rezeptor bestimmt werden, der auf unreifen, lang-zeit repopulierenden HSZ zu finden ist. In dieser Arbeit wurde bestätigt, dass humanes CD105 auf 30-80% der humanen CD34+ Zellen exprimiert wird. Anschließend wurden CD34+ Zellen mit einem lentiviralen Vektor transduziert, der an den humanen CD105 Rezeptor (CD105-LV) der Zielzellen bindet, und in NOD-scid IL2Rγ-/- Mäuse transplantiert. In allen humanen hämatopoetischen Linien im Knochenmark, Milz und Blut wurde eine langfristig stabile Expression des Reportergens nachgewiesen. In einem Kompetitionsexperiment konnte außerdem gezeigt werden, dass CD34+ Zellen, die mit CD105-LV transduziert wurden, in Knochenmark und Milz einen höheren Transplantationserfolg zeigten als Zellen, die mit einem konventionellen nicht ziel-gerichteten lentiviralen Vektor transduziert wurden. Dies bestätigt CD105 als Marker für primitive HSZ, die eine hohe Repopulationseigenschaft besitzen. Die Daten, die in dieser Arbeit gezeigt werden, verdeutlichen das Potential von Vektoren, mittels Rezeptortargeting Zellsubpopulationen zu markieren und zu verfolgen, was eine Identifikation von neuen Markern auf spezifischen Zellpopulationen ermöglicht. Des Weiteren demonstriert diese Arbeit die Möglichkeit, verschiedene virale Vektortypen, die den gleichen Zelleintrittsrezeptor verwenden, zu vergleichen.German
Place of Publication: Darmstadt
Classification DDC: 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 500 Naturwissenschaften
500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Divisions: 10 Department of Biology
Date Deposited: 29 Jul 2015 09:56
Last Modified: 29 Jul 2015 09:56
URN: urn:nbn:de:tuda-tuprints-46685
Referees: Süß, Prof. Dr. Beatrix and Nuber, Prof. Dr. Ulrike A. and Buchholz, Prof. Dr. Christian J.
Refereed: 17 July 2015
URI: http://tuprints.ulb.tu-darmstadt.de/id/eprint/4668
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